Вирусингибирующее действие комплексного индуктора интерферонов I типа in vivo при экспериментальной герпетической инфекции

Введение

Вирусу простого герпеса (ВПГ) принадлежит этиологическая роль в возникновении таких тяжелых заболеваний, как гепатит, энцефалит, менингит и мененгоэнцефалит вирусной природы. Чаще всего к таким последствиям приводит инфицирование ВПГ новорожденных, среди которых при поражении центральной нервной системы наблюдается 50% смертность, а генерализованная инфекция ВПГ приводит к 60% смертей на первом году жизни [1]. Патология ВПГ-инфекции вызывается преимущественно прямым цитопатическим действием вируса, результатом которой является клеточный лизис и фокусный некроз инфицированной области. В тканях, способных к регенерации, цитопатическое действие ВПГ не является слишком опасным при условии, что вирусное повреждение не полностью уничтожает орган или приводит к функциональной неспособности инфицированных органов во время болезни. Однако в мозгу способность к регенерации поврежденных тканей низкая и обширные некрозы, индуцированные ВПГ, приводят к летальному исходу [2]. Таким образом, ранний контроль репликации ВПГ на начальных фазах инфицирования является решающим для больного. Раннее ингибирование репликации ВПГ может предупредить распространение инфекции, а ранние неспецифические иммунные реакции создают потенциал для препятствования развития симптоматической инфекции. Поэтому достаточно актуальным является поиск и разработка эффективных противогерпетических препаратов.

Параллельно с использованием этиотропных противовирусных средств в терапии ВПГ-инфекций все большее распространение получают разнообразные иммунотерапевтические препараты. Патогенетическим обоснованием иммунотерапии в данном случае является принципиальная возможность управления формированием и уровнем напряженности иммунного ответа к антигенам ВПГ. Среди препаратов этого типа выделяют индукторы интерферонов (ИФН) [3]. Ранее нами была выявлена способность молекулярной композиции (МК) на основе дрожжевой РНК и 2, 7-бис[2-(диэтиламино-этокси)-флуорен]-9-он дигидрохлорида (тилорона, субстанции лекарственных препаратов Амиксин, Левомакс), индуцировать a/b-ИФН в условиях как in vitro, так и in vivo [4, 5]. В условях in vitro доказано противовирусное действие МК на моделях ряда РНК-содержащих вирусов, включая ВИЧ [6]. В связи с изложенным выше, задачей исследования было изучение противовирусной активности комплексного индуктора интерферонов I типа — МК в условиях in vivo на модели ДНК-содержащего вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1).

Цель исследования

Целью данной работы была оценка влияния МК на среднюю продолжительность жизни инфицированных мышей, а также уровень репликации ВПГ-1 в мозговой ткани животных при экспериментальном герпетическом менингоэнцефалите.

Материалы и методы

Для создания модели герпетического менингоэнцефалита использовали мышей линии BALB/c весом 10–12 г. В работе использовали здоровых животных, выдержанных на карантине, без признаков заболевания. Содержание и обращение с подопытными животными отвечали требованиям «Европейской конвенции по защите прав позвоночных, используемых для экспериментальных и других целей».

Приготовление композиции МК описано ранее [4, 5]. В качестве компонентов использован коммерческий препарат дрожжевой РНК («Биохимреактив», Латвия) и тилорон гидрохлорид («Sigma», США) в мольном соотношении 10:1 соответственно. Препаратами сравнения служили эталонный индуктор ИФН І типа — poly(І)-poly© («Sigma») и стандартный противогерпетический препарат — Виролекс («KRKA», Slovenia).

В работе использован вирус простого герпеса ВПГ-1 штамм Л2. С целью изучения влияния препарата МК на репликацию ВПГ-1 на модели герпетического менингоэнцефалита животных инфицировали интрацеребрально ВПГ-1 в дозе 100 ЛД₅₀/0,025 мл (титр вируса составлял 5 lg ЛД₅₀). Изучаемые препараты вводили по терапевтической схеме двукратно (через сутки и через трое суток после инфицирования ВПГ-1) внутрибрюшинно в ранее определенных дозах, вызывающих максимальную продукцию ИФН: МК — 1, 46 мг/кг, poly(І)-poly© — 0, 66 мг/кг массы животных [5]; Виролекс вводили в дозе, используемой при лечении ВПГ-1-инфекции [7] — 100 мг/кг веса животных. Контрольным инфицированным животным вводили физраствор. В составе каждой группы было по 25 лабораторных животных.

Эффективность анти-ВПГ действия МК, препаратов сравнения, а также адекватность избранной схемы их введения оценивали динамическим методом оценки противовирусной активности веществ [8, 9]. С момента, когда смертность животных в контрольной группе превышала 50% и до конца периода наблюдения (100% смертность животных контрольной группы), во всех опытных группах определяли уровень защиты препарата по формуле:

Среднюю продолжительность жизни инфицированных мышей рассчитывали по Мейнеллу [10]. Подсчеты проводили с помощью IBM PC с использованием пакета программных средств Microsoft Excel [11].

Для оценки уровня репликации ВПГ-1 в мозговой ткани забивали инфицированных животных мышей (по 5 животных каждой группы) путем вскрытия шейной вены под легким эфирным наркозом. После вскрытия черепно-мозговой коробки извлекали мозговую ткань, объединяя в пул образцы животных каждой группы. Полученные образцы мозговой ткани растирали со стерильным песком до однородной массы, добавляя соответствующий объем физиологического раствора для получения 10% суспензии. Указанную суспензию центрифугировали при 8 тыс. об/мин. В надосадочной жидкости определяли активность вируса. Для определения титра ВПГ-1 осуществляли ее десятикратные разведения. Уровень репликации ВПГ-1 оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в полуколичественной модификации с использованием тест-системы «АмплиСенс ВПГ I, II-430» (Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва). После выделения ДНК из мозговой суспензии инфицированных животных проводили ПЦР на амплификаторе «Perkin Elmer» (США) по программе (табл. 1).

Таблица 1 — Программа ПЦР для выявления ДНК ВПГ-1

Учет продуктов ПЦР-амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле в УФ-свете (λ = 302 нм), по наличию или отсутствию на электрофореграммах специфических полос амплифицированной ДНК. В качестве красителя использовали бромистый этидий. Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК для ВПГ-1 составляла 430 п.н. Положительными считали образцы, содержавшие специфическую полосу на уровне 430 п.н. большей или меньшей интенсивности. Отрицательными считали образцы, не содержавшие полосы на указанном уровне. Изображение геля в УФ-свете получали на мониторе компьютера с помощью видеосистемы «BIOTEST-A» («BIOKOM», Россия).

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований были проанализированы летальность и средняя продолжительность жизни инфицированных ВПГ-1 мышей получавших МК или препараты сравнения. Полученные в этих опытах результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 — Летальность и средняя продолжительность жизни инфицированных ВПГ-1 мышей, получавших МК или препараты сравнения

Примечания: численность каждой группы — 25 животных; ^*р < 0, 001; ^**р > 0, 05 к контролю.

В наших экспериментальных условиях развитие герпетического менингоэнцефалита у контрольных инфицированных ВПГ-1 животных сопровождалось 100% летальностью на протяжении 6–9 дней после инфицирования. При этом средняя продолжительность жизни в данной группе животных составляла 6, 86 суток (табл. 2). В то же время в группе животных, получавших МК, летальность за весь период наблюдения (21 сутки) оказалась в 5 раз ниже, а средняя продолжительность жизни увеличилась в 1, 5 раза по сравнению с контролем. Терапевтическая эффективность препаратов сравнения — рoly(І)-poly© и Виролекса — в этих опытах оказалась практически одинаковой для обеих групп: смертность животных составила 40%. При этом средняя продолжительность жизни животных, получавших Виролекс, статистически не отличалась от контрольной группы и составляла 6, 93 суток, а у животных, получавших рoly(І)-poly© была несколько выше: 8, 1 суток. Таким образом, примененная схема введения исследуемых препаратов обеспечивала уменьшение смертности инфицированных ВПГ животных на 50–80%. При этом, в сравнении с официнальными препаратами, МК выявил наибольший анти-ВПГ эффект: жизнеспособность животных, получавших МК была в 5 раз большей, чем в контроле, в то время как Виролекс и рoly(І)-poly© имели данный показатель практически в 2 раза ниже.

Для более углубленного изучения противовирусного действия исследуемых препаратов проводилась оценка их противовирусной активности в динамике, начиная со дня гибели 50% животных в контрольной инфицированной группе (6-й день). Определение проводилось по методу оценки динамики противовирусной активности препаратов, предложенном С. В. Грибенча [8]. Метод базируется на сопоставлении данных о гибели животных в контрольной и опытных группах, а соответственно, и на определении процента защиты животных в течение различных дней постановки эксперимента. На рисунке1 приведена динамика изменения уровня защиты инфицированных мышей под действием взятых в исследование препаратов.

Рисунок 1 — Динамика противовирусной активности исследуемых препаратов на модели экспериментального герпетического менингоэнцефалита у мышей

Как видно из рисунка 1, наибольший уровень защиты (100%) от ВПГ-1-инфекции, зафиксирован на 6–9 сутки после инфицирования в группе животных, получавших МК. В контрольной группе инфицированных животных, с увеличением срока со дня их инфицирования, повышался процент смертности мышей и соответственно уменьшался процент защиты: на 9 сутки наблюдалась 100% летальность животных.

В группе животных, получавших poly(I)-poly©, наибольший процент защиты (70%) наблюдался на 9–11 сутки после инфицирования животных ВПГ-1. Животные, получавшие Виролекс, имели наибольший процент защиты (65%) на 9–10 сутки от момента инфицирования.

На 12 сутки после инфицирования животных ВПГ-1 уровень защиты во всех исследуемых группах стабилизировался и оставался постоянным до конца эксперимента: в группе животных, получавших МК он составил 80%, poly(I)-poly© и Виролекс — 60%, в контрольной группе инфицированных животных — 0%.

Таким образом, применение МК обеспечивает максимальный уровень защиты как в начальный период (100% выживших животных), так и на 10–15 сутки после инфицирования (конечный срок эксперимента), что свидетельствует об эффективности и существенном пролонгированном действии комплексного индуктора интерферонов І типа — МК — в условиях герпетического менингоэнцефалита.

Уровень репликации ВПГ-1 в мозговой ткани исследуемых животных определяли с помощью полимеразной цепной реакции. Пробы отбирались на 6 сутки после инфицирования животных ВПГ-1, поскольку в это время наблюдалась 50% смертность подопытных животных. Из мозговой ткани инфицированных животных готовились последовательные десятикратные разведения мозговой суспензии для относительного количественного определения ВПГ-1. Результаты ПЦР представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 — ПЦР-анализ уровня репликации ВПГ-1 в пулированных образцах мозговой ткани мышей при экспериментальном герпетическом менингоэнцефалите на 6 сутки после инфицирования. А — полосы: 1(К-) — отрицательный контроль амплификации; 2, 3 — разведение мозговой суспензии (МС) контрольной инфицированной группы животных — 10^-3 и 10^-4соответственно; 4, 5 — разведение МС группы инфицированных животных, которым вводили МК — 10^-3 и 10^-4соответственно; 6, 7 — разведение МС группы инфицированных животных, которым вводили poly(I)-poly© — 10^-3 и 10^-4соответственно; 8, 9 — разведение МС группы инфицированных животных, которым вводили Виролекс — 10^-3 и 10^-4соответственно; 10 (К+) — положительный контроль амплификации (430 п.н.). Б — полосы: 1(К-) — отрицательный контроль амплификации; 2, 3 — разведение МС контрольной инфицированной группы животных — 10^-5, 10^-6 соответственно; 4, 5 — разведение МС группы инфицированных животных, которым вводили МК — 10^-1, 10^-2 соответственно; 6 (К+) — положительный контроль амплификации (430 п.н.).

Таким образом, показано, что двукратное внутрибрюшинное введение МК после инфицирования ВПГ-1 обеспечивает существенное снижение уровня репликации вируса в тканях мозга подопытных животных. В группе контрольных инфицированных животных уровень ВПГ-1 в ткани составлял 5 lg LD₅₀, тогда как введение МК обеспечивало снижение уровня репликации этого вируса на 4 lg; применение Виролекса и рoly(І)-poly© обеспечивало снижение уровней репликации ВПГ-1 на 2 lg.

Следовательно, исходя из полученных данных определения уровней репликации ВПГ-1 в пулированных образцах мозговой ткани инфицированных животных можно заключить, что наибольший вирус ингибирующий эффект среди исследуемых препаратов обнаружен у молекулярной композиции — МК — на основе дрожжевой РНК и 2, 7-бис[2-(диэтиламино-этокси)-флуорен]-9-он дигидрохлорида (тилорона). При этом препараты сравнения — Виролекс и рoly(І)-poly© имели соответствующий показатель на 2 lg ниже МК.

Выводы

Таким образом, по результатам как изучения продолжительности жизни инфицированных мышей, так и определения интенсивности репродукции ВПГ-1 в мозговой ткани животных, существенная противогерпетическая активность показана для молекулярной композиции дрожжевой РНК и тилорона. Ее двукратное введение животным на первые и третьи сутки после инфицирования ВПГ-1 обеспечивает, в сравнении с известными противовирусными препаратами Виролексом и рoly(І)-poly©, наибольшую среднюю продолжительность жизни, максимальный процент защиты на протяжении всего эксперимента, а также минимальный падеж инфицированных животных.

Как показано ранее, в анти-ВПГ эффекте МК существенную роль может играть ее интерферон индуцирующая активность в организме [12]. При этом нельзя исключать и непосредственного влияния на общий анти-ВПГ эффект низкомолекулярного компонента МК — тилорона, который сам по себе способен ингибировать репродукцию вирусов [13], хотя и в значительно более высоких концентрациях, чем использовались в наших опытах. Для объяснения механизма обнаруженной высокой эффективности дрожжевой РНК и 2, 7-бис[2-(диэтиламино-этокси)-флуорен]-9-он дигидрохлорида (тилорона) в составе МК необходимы более углубленные молекулярно-биологического исследования.

Полученные результаты вирус ингибирующей активности МК позволяют рассматривать ее как перспективное противогерпетическое средство, характеризующееся большей эффективностью в сравнении с взятыми в исследование официальными препаратами.

Литература

1. Kimberlin D. W. Neonatal herpes simplex infection // Clin. Microbiol Rev. — 2004. — Vol. 17. — P. 1 — 13.
2. Whitley R. J. Herpes simplex virus infections of women and their offspring: implications for a developed society // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1994. — Vol. 91. — P. 2441 — 2447.
3. Ершов Ф. И., Тазулахова Э. Б. Индукторы интерферона — новое поколение иммуномодуляторов // Вестн. Рос. АМН. — 1999. — № 4. — С. 52 — 56.
4. Карпов А. В., Жолобак Н. М. Изучение интерфероногенных свойств комплексов дрожжевая РНК-тилорон в культуре клеток // Антибиотики и химиотерапия. — 1995. — № 5. — C. 20 — 23.
5. Карпов А. В., Жолобак Н. М. Продукция интерферонов I типа в организме под действием молекулярных комплексов дрожжевая РНК-тилорон // Вопр. вирусол. — 1996. — № 1. — С. 13 — 16.
6. Karpov A. v. , Zholobak N. M., Spivak N. Ya., Rybalko S. L., Antonenko S. v. , Krivokhatskaya L. D. Virus-inhibitoty effect of a yeast RNA-tilorone molecular complex in cell ciltures // Acta Virologica. — 2001 — Vol. 45 — Р. 181 — 184.
7. Haruhiko M., Takao I., Noriyuki A. Comparison of antiviral efficacies of 1-b-D-arabinofuranosyl-E-5-(2-bromovinyl)uracil (brovavir) and acyclovir against herpes simplex virus type 1 infections in mice // Antiviral Res. — 1990 — Vol. 14 — Р. 99 — 108.
8. Грибенча С. В., Холмс Р. Д., Атауллаханов Р. И., Баринский И. Ф. Противовирусная активность пептидного иммуномодулятора «Гепон» в экспериментах на модели уличного вируса бешенства // Вопр. вирусол. — 2003. — № 4 — С. 40 — 44.
9. Щербинська А.М., Дяченко Н. С., Рибалко С. Л, Носач Л. М., Дядюн С. Т., Вричану Н. О. Вивчення антивірусної дії потенційних лікарських засобів. В кн. Доклінічні дослідження лікарських засобів. К. — 2001. — С. 371 — 395.
10. Пшеничнов В. А., Семенов Б. В., Зезеров Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. — М.: Медицина, 1974. — 168 с.
11. Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с применением «Excel». — К.: Морион, 2000. — 320 с.
12. Скроцкая О. И., Жолобак Н. М., Карпов А. В., Антоненко С. В., Спивак Н. Я. Вплив комплексного індуктора інтерферону на експериментальну герпетичну інфекцію // Докл. НАН Украины — 2005 — № 5 — С. 164 — 166.
13. Чижов Н. П., Борисова М. А. Структура и биологическая активность низкомолекулярных индукторов интерферона // Антибиотики и мед. Биотехнология — 1987 — Т. 32, № 9 — С. 706 — 715.

Literature

1. Kimberlin D. W. Neonatal herpes simplex infection // Clin. Microbiol Rev. — 2004. — Vol. 17. — P. 1 — 13.
2. Whitley R. J. Herpes simplex virus infections of women and their offspring: implications for a developed society // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1994. — Vol. 91. — P. 2441 — 2447.
3. Ershov F. I., Tazulaxova E. B. Induktory interferona — novoe pokolenie immunomodulyatorov // Vestn. Ros. AMN. — 1999. — № 4. — P. 52 — 56.
4. Karpov A. v. , Zholobak N. M. Izuchenie interferonogennyx svojstv kompleksov drozhzhevaya RNK-tiloron v kul’ture kletok // Antibiotiki i himioterapiya. — 1995. — № 5. — P. 20 — 23.
5. Karpov A. v. , Zholobak N. M. Produkciya interferonov I tipa v organizme pod dejstviem molekulyarnyx kompleksov drozhzhevaya RNK-tiloron // Vopr. virusol. — 1996. — № 1. — P. 13 — 16.
6. Karpov A. v. , Zholobak N. M., Spivak N. Ya., Rybalko S. L., Antonenko S. v. , Krivokhatskaya L. D. Virus-inhibitoty effect of a yeast RNA-tilorone molecular complex in cell ciltures // Acta Virologica. — 2001 — Vol. 45 — P. 181 — 184.
7. Haruhiko M., Takao I., Noriyuki A. Comparison of antiviral efficacies of 1-b-D-arabinofuranosyl-E-5-(2-bromovinyl)uracil (brovavir) and acyclovir against herpes simplex virus type 1 infections in mice // Antiviral Res. — 1990 — Vol. 14 — Р. 99 — 108.
8. Gribencha S. v. , Xolms R. D., Ataullaxanov R. I., Barinskij I. F. Protivovirusnaya aktivnost' peptidnogo immunomodulyatora «Gepon» v e’ksperimentax na modeli ulichnogo virusa beshenstva // Vopr. virusol. — 2003. — № 4 — P. 40 — 44.
9. Shherbins’ka A. M., Dyachenko N. S., Ribalko S. L, Nosach L. M., Dyadyun S. T., Vrichanu N. O. Vivchennya antivіrusnoї dії potencіjnix lіkars’kix zasobіv. V kn. Doklіnіchnі doslіdzhennya lіkars’kix zasobіv. K. — 2001. — P. 371 — 395.
10. Pshenichnov v. A., Semenov B. v. , Zezerov E. G. Standartizaciya metodov virusologicheskix issledovanij. — M.: Medicina, 1974. — 168 p.
11. Lapach S. N., Chubenko A. v. , Babich P. N. Statisticheskie metody v mediko-biologicheskix issledovaniyax s primeneniem «Excel». — K.: Morion, 2000. — 320 p.
12. Skrockaya O. I., Zholobak N. M., Karpov A. v. , Antonenko S. v. , Spivak N. Ya. Vpliv kompleksnogo іnduktora іnterferonu na eksperimental’nu gerpetichnu іnfekcіyu // Dokl. NAN Ukrainy — 2005 — № 5 — P. 164 — 166.
13. Chizhov N. P., Borisova M. A. Struktura i biologicheskaya aktivnost' nizkomolekulyarnyx induktorov interferona // Antibiotiki i med. Biotexnologiya — 1987 — T. 32, № 9 — P. 706 — 715.