Анализ функциональной значимости полиморфных локусов генов ассоциированных с нарушениями сперматогенеза

Введение

Изучение молекулярно-генетических механизмов, отвечающих за правильное протекание сперматогенеза, является одной из актуальных проблем в современной медицине. На сегодняшний день многие полиморфные локусы, ассоциируемые с нарушением процесса сперматогенеза, хорошо изучены и являются диагностическими маркерами бесплодия, например мутации генов SRY, AMG, AMGL, микроделеция в гене AZF.   В GWAS каталоге зарегистрировано 138 генетических вариантов, обнаруженных в 34  полногеномных исследованиях ассоциированных с мужским бесплодием.   Однако, во всех 34 исследованиях регистрируются различные  полиморфные локусы в различных генах (https://www.ebi.ac.uk/gwas).  При этом все эти хорошо изученные мутации и  полиморфные локусы  ассоциированные  в полногеномных исследованиях не диагностируют все возможные генетические нарушения процесса сперматогенеза, которые приводят к мужскому бесплодию. Доля идиопатического мужского бесплодия остается достаточно значительной.  Для «открытия» новых генетических вариантов ассоциированных с процессами нарушения регуляции сперматогенеза и функции сперматозоидов, мы с помощью биоинформатических подходов, изучили функциональную значимость ранее не исследованных генетических вариантов, которые локализуются в генах, приводящих к развитию 15 редких моногенных заболеваний, в сиптомокомплексе которых  регистрируются нарушения процесса сперматогенеза. Из анализа были исключены мутации приводящие к моногенным заболеваниям. С широким  внедрением секвенирования нового поколения (NGS), появился поток больших данных о последовательностях ДНК, и  становится всё более важным уметь определять приоритетность вариантов с потенциальным функциональным эффектом. Для выявления «вредных» генетических вариантов по принципу «кодон-кодон» было разработано множество биоинформатических инструментов. Современные биоинформационные инструменты, предназначенные для оценки влияния генетических вариаций на функцию белка, используют различные подходы, поэтому мы использовали в своей работе несколько инструментов, прогнозирующих уровень значимости генетических вариантов:  в том числе SIFT, PolyPhen2, MutPred,  PROVEAN, Meta SVM/LR, PredictSNP2 и   Revel.

Материал и методы

Из базы данных наследственных болезней OMIM было отобрано 15 генов, обладающих плейотропным эффектом в сиптомокомплексе которых  регистрируются нарушения процесса сперматогенеза (таблица 1).  Для каждого из 15  генов мы изучили уровень экспрессии, представленный в базе данных NCBI, выполненный в международном проекте при анализе транскриптомного уровня всех белок кодирующих генов человека в 27 тканях (BioProject: PRJNA270632; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).  Уровень экспрессии генов в тестикулярной ткани  относительно их транскрипционной активности во всех  других тканях  организма варьировал в пределах от 98,72 % до 4,76 % .  В этих генах был проведен анализ функциональной значимости генетических вариантов (таблица 2).   Из анализа были исключены мутации приводящие к моногенным заболеваниям. В работе использованы следующие инструменты, прогнозирующие уровень значимости генетических вариантов: Как видно из таблицы 2, использую базы данных международного проекта 1000 геномов, геномного браузера UCSC (Университета Калифорнии Санта Круз, США ) и NCBI (Национального центра биотехнологической информации, США)  мы обнаружили 6227 SNP в исследуемых генах . 

Таблица 1.

  Панель исследуемых генов, мутации в которых вызывают моногенные болезни и вмести с ними нарушают регуляцию сперматогенеза

Талица 2.  

Уровень экспрессии в тестикулах относительно других тканей  организма  и число генетических вариантов

PROVEAN (https://www.jcvi.org/research/provean) был разработан для прогнозирования  изменений последовательности белка на функцию белка. PROVEAN способен предоставлять прогнозы для любого типа вариаций последовательности белка, включая: одиночные или множественные аминокислотные замены; одиночные или множественные вставки аминокислот; делеции одной или нескольких аминокислот. Если показатель PROVEAN равен или ниже заранее определенного порогового значения (например, -2,5), прогнозируется, что вариант белка окажет "вредный" эффект. Если оценка PROVEAN превышает пороговое значение, прогнозируется, что вариант будет иметь "нейтральный" эффект (Choi, Y., Chan, A.,2015).

SIFT - Sorting Intolerant From Tolerant (https://sift.bii.a-star.edu.sg)  — это основанный на гомологии последовательностей инструмент, сортирующий не толерантные и толерантные аминокислотными замены и прогнозирует будет ли аминокислотная замена в белке будут иметь фенотипический эффект. SIFT способен предсказать какие единичные аминокислотные замены оказывать фенотипический эффект. Прогнозируется, что позиции с нормализованной вероятностью менее 0,05 будут вредными, прогнозируется, что позиции, превышающие или равные 0,05, будут допустимыми (Ng, P., Henikoff, S. , 2001)

PolyPhen-2 - Polymorphism Phenotyping v2, (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) доступный в виде программного обеспечения и через веб-сервер, предсказывает возможное влияние аминокислотных замен на стабильность и функционирование белков человека, используя структурные и сравнительные эволюционные исследования. (Adzhubei et al., 2010).

MutPred —   http://mutdb.org/mutpredsplice. это биоинформатический инструмент использует машинное обучение для анализа различных функциональных эффектов генной мутации, включая изменения доменной структуры, изменения связывания белков, изменения аминокислотных замен (Pejaver et al., 2020).

Проверка предсказанных значимых  генетических вариантов далее определась в программах PredictSNP2  и Revel, основанных на комбинациях различных предсказательных методах.

PredictSNP2 (https://loschmidt.chemi.muni.cz/predictsnp2)— это инструмент для прогнозирования влияния единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) на функцию белков. PredictSNP использует публичные базы данных геномных вариаций, такие как dbSNP и Ensembl, в качестве исходных материалов для предсказания функциональных последствий SNP. Инструмент анализирует различные признаки, такие как расположение SNP в гене, характер аминокислотной замены и существующие аналоги у других видов, чтобы определить вероятность, что ENP относится к классу патогенных мутаций (Bendl et al., 2016).

Revel (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=revel) В программе  использует алгоритм, основанный на комбинации показателей 13 отдельных инструментов: MutPred, FATHMM v2.3, VEST 3.0, PolyPhen-2, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP++, SiPhy, phyloP и phastCons, что позволяет получить наиболее точную оценку патогенности. Инструмент также использует базу данных ClinVar, содержащую клинически значимые генетические варианты, и сравнивает обнаруженные варианты с этой базой данных. Revel позволяет пользователям анализировать данные экзомного секвенирования и оценивать патогенность генетических вариантов. Инструмент также использует базу данных ClinVar, содержащую клинически значимые генетические варианты, и сравнивает обнаруженные варианты с этой базой данных (Ioannidis et al., 2016).

Meta SVM  —(Meta Support Vector Machine) —позволяет разделять данные на две категории и строить границу между ними, что делает его полезным для классификации белков на основе их структуры и последовательности аминокислот (Dong et al., 2015).

Meta LR (Meta Logistic Regression) — это метод классификации белков, использующий логистическую регрессию. В биоинформатике он очень полезен для анализа белков, поскольку позволяет изучать, какие факторы могут влиять на функцию белка и свойства его структуры (Dong et al., 2015).

Результаты исследований

 Для получения массивов данных об однонуклеотидных заменах для отобранных нами по уровню транскрипционной активности 15 генов был задействован геномный браузер UCSC, при помощи него из базы данных dbSNP были получены массивы данных, по каждому анализируемому гену.  При помощи пакета «Pandas» для «Python» массивы были отформатированы в таблицы со следующими столбцами: «хромосома», «позиция на хромосоме», «рефересная аллель», «альтернативная аллель»; пример подобного массива представлен в таблице 3.

Таблица 3

 Фрагмент отсортированного массива по гену DNAH1

Следующим этапом нашей работы был биоинформационный анализ 6227 генетических локусов в генах.  Анализ разделен на два этапа — это анализ влияния исследуемых SNP на функцию гена, при помощи различных программ работающих с аминокислотной последовательностью продукта гена, на втором этапе производился анализ нуклеотидной последовательности.   

В таблице 4 приведены результаты запроса из базы данных dbNSFP по соответствующим программам. SIFT, PROVEAN и Polyphen2 – интерпретируют свои результаты в виде буквенных диагнозов для SIFT это «D» и «T», deleterious (вредный) и tolerance (нейтральная) соответственно, PROVEAN аналогично SIFT интерпретирует свой результат в бинарном формате, мутации не имеющие существенного влияния помечены как «N» neutral (нейтральный), у Polyphen2 диагноз немного расширен «B» означает синонемическую замену (benign), «P» возможно повреждающую.

D-deleterius – значимые, несинонимические мутации; вредные

T-tollerance – незначимые мутации, толерантные, нейтральные мутации;

P – пограничные мутации;

N- нейтральные, синонемичные, незначимые, толерантные мутации;

B – benign – доброкачественная, синонимичные, возможно значимые.

Как видно из представленных результатов прогнозы фенотипического проявления SNP в разных программах не всегда совпадают.

Для дальнейших исследований мы отобрали генетические варианты прогнозы, для которых совпали в двух или больше программ и провели оценку прогностической значимости генетических вариантов с помощью программ Meta SVM/LR, REVEL и Predictsnp2. Результат вычислений представлен в таблице 5.

Meta SVM/LR – имеет бинарную интерпретацию своего результата «D» и «Т» что означает deleterious (вредный) и tolerance (нейтральная) соответственно. REVEL по аналогии с MutPred выдает свои результаты в цифровом виде в диапазоне от 0 до 1, где значение ближе к 1 означает большее влияние на функцию гена, с 0 обратная ситуация, для наглядности уровень значимости промаркирован цветом.

Следующим этапом были произведены расчеты прогностической значимости SNP при помощи программы Predictsnp2.  Отличительной особенностью данного инструмента является то, что он в качестве анализируемых данных использует нуклеотидную последовательность что позволяет узнать не только как мутация влияет непосредственно на сам ген, но и место, где произошла мутация и ее тип. В таблице 6 ниже приведены расчеты для SNP обнаруженными при помощи методов, указанных выше. Predictsnp2 интерпретирует свои результаты в бинарном формате «N» и «D» нейтральная (neutral) и (deleterious)   «вредная» соответственно.

 Таким образом, в результате биоинформационного анализа  из 6227 SNP в исследуемых генах, нами отобрано 11 генетических вариантов для дальнейших верификационных исследований :   rs56079734;  rs35611758; rs13060192; rs74363541; rs17052095; rs61739896; rs419752; rs73507255; rs555164;  rs12084067.

Все найденные 11  генетических вариантов находятся в экзонах и согласно полученным прогнозам влекут за собой снижение функциональности белка.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания в сфере научной деятельности № FENW-2023-0018.

Список литературы (References)

1. Adzhubei, I. A., Schmidt, S., Peshkin, L., Ramensky, V. E., Gerasimova, A., Bork, P., ... & Sunyaev, S. R. (2010). A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature methods, 7(4), 248-249.
2. Bendl, J., Musil, M., Štourač, J., Zendulka, J., Damborský, J., & Brezovský, J. (2016). PredictSNP2: a unified platform for accurately evaluating SNP effects by exploiting the different characteristics of variants in distinct genomic regions. PLoS computational biology, 12(5), e1004962.
3. Choi, Y., & Chan, A. P. (2015). PROVEAN web server: a tool to predict the functional effect of amino acid substitutions and indels. Bioinformatics, 31(16), 2745-2747.
4. Dong, C., Wei, P., Jian, X., Gibbs, R., Boerwinkle, E., Wang, K., & Liu, X. (2015). Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Human molecular genetics, 24(8), 2125-2137.
5. Ioannidis, N. M., Rothstein, J. H., Pejaver, V., Middha, S., McDonnell, S. K., Baheti, S., ... & Sieh, W. (2016). REVEL: an ensemble method for predicting the pathogenicity of rare missense variants. The American Journal of Human Genetics, 99(4), 877-885.
6. Ng, P. C., & Henikoff, S. (2001). Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome research, 11(5), 863-874.
7. Pejaver, V., Urresti, J., Lugo-Martinez, J., Pagel, K. A., Lin, G. N., Nam, H. J., ... & Radivojac, P. (2020). Inferring the molecular and phenotypic impact of amino acid variants with MutPred2. Nature communications, 11(1), 5918.
8. Sherchkova, T. A., Grigoryan, N. A., Amelina, M. A., Lomteva, S. V., Alexandrova, A. A., Mashkina, E. V., & Shkurat, T. P. (2021). Role of XRCC1, XPC, NBN gene polymorphisms in spermatogenesis. Gene Reports, 24, 101238.

Статья поступила в редакцию 25 марта 2025 г.

Принята к печати 31  марта 2025 г.

Received 25, March, 2025

Accepted 31, March, 2025