Транскриптомный профиль микро РНК в кумулюсных гранулезных клетках человека

Введение

Фолликул яичника - это основная структурная и функциональная единица яичника.  В фолликуле содержится ооцит 1-го порядка, окруженный слоем гликопротеидов, которые в свою очередь окружены слоем гранулезных клеток. Клетки гранулезы  являются  важным соматическим компонентом яичника.  Два разных типа гранулезных клеток, муральные гранулезные клетки и гранулезные клетки кумулюса, выполняют разные функции во время фолликулогенеза. Муральные гранулезные клетки вырабатывают эстроген во время фолликулярной фазы и прогестерон после овуляции, в то время как гранулезные клетки кумулюса плотно окружают ооцит и образуют кумулюс оофорус и внутренний слой клеток лучистого венца.  Гранулезные клетки участвуют в двунаправленном обмене метаболитами с ооцитом, поскольку они образуют щелевые контакты, которые имеют решающее значение как для правильного созревания ооцита, так и для пролиферации гранулезных клеток. Взаимодействие между гранулезными клетками и ооцитами имеет решающее значение для скоординированного созревания ооцитов (Adriaenssens T, et al., 2011; Dompe, C., et al., 2021). Межклеточное взаимодействие между ооцитом и гранулезными клетками  может быть опосредовано паракринной, аутокринной или эндокринной сигнализацией и отвечает за метаболическое взаимодействие, которое включает перенос глюкозы, нуклеотидов, аминокислот и метаболитов к яйцеклетке. Тесная взаимосвязь между ооцитом, гранулезными клетками и клетками-предшественниками поддерживает развитие фолликулов и созревание ооцитов посредством биосинтеза стеролов, регуляции мейоза, транскрипции генов и защиты ооцитов (Albertini D, et al., 2000; Assou S, et al.,2006; Tong, X. et al., 2014).

МикроРНК (miRNA)  универсальные регуляторы  экспрессии генов, они комплементарно спариваются с участками мРНК и ингибируют их трансляцию (Bartel, D.2004). Они связываются с 3'-нетранслируемой областью (3'-UTR) мРНК и вызывают ингибирование трансляции или деградацию мРНК,  комплементарное связывание с соответствующими мРНК, ведет к ингибированию трансляции  и деградации мРНК,  и  приводит к прекращению дальнейшей трансляции белка (Ambros, V. 2004).  Известно, что таким способом  микроРНК регулируют  более 60% генов человека  В геноме человека закодировано несколько тысяч микро РНК, образующих регуляторные сети, участвующие в сигнальных путях и различных клеточных процессах miRNA играет важнейшую регуляторную роль на разных стадиях онтогенеза, в норме и патологии  (Griffiths-Jones, S., 2006; Аушев В., 2015; Кучер А., Бабушкина Н., 2011; Kozomara, A., 2019; Мустафин, Р.,Хуснутдинова, Э. 2025). В редких случаях микроРНК также могут положительно влиять на трансляцию и экспрессию генов (Sekar et al., 2016, Saravanan et al., 2015). С функциональной точки зрения отдельная миРНК так же важна, как и фактор транскрипции, поскольку она способна регулировать экспрессию множества генов-мишеней (Kozomara, A., 2019; Shang R. et al., 2023). Таким образом, микроРНК могут быть ключевыми регуляторами развития, физиологии и заболеваний  (Erson, A., Petty, E.,2008; Sayed, D.,Abdellatif, M.,2011; Searles, C.2024; Cui, Y., et al.,2024;   Омельчук, Е., и др., 2024). Несмотря на то, что основные особенности биогенеза и функционирования миРНК были открыты боле 20 лет назад, в последние годы продолжает раскрываться фундаментальная информация о структурной и молекулярной динамике основного механизма miRNA, о том, как субстраты и мишени  miRNA отбираются из транскриптома, о новых путях многоуровневой регуляции биогенеза miRNA и механизмах взаимодействий miRNA, о их новой роли в регуляции  клеточных процессов в онтогенезе.

Целью настоящего исследования было изучение транскриптомного профиля miRNA в кумулюсных гранулезных клетках человека.

Материал и методы

В полногеномном транскриптомном профилировании были использованы биологические образцы 5 женщин в возрасте от 26 до 34 лет: Все женщины  были здоровы и включены в программу экстракорпорального оплодотворения по  фактору мужского бесплодия. Для всех пациенток во время овариальной стимуляции использовали короткий протокол с антагонистами гонадотропинрелизинг гормона (Цетротид, Zentaris GmbH, Германия). Контролируемую гиперстимуляцию яичников вызывали введением рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (Гонал- ф Merck Serono, Италия) и человеческого менопаузального гонадотропина (Мериоферт, IBSA, Швейцария) в индивидуальных дозах гонадотропина. Овуляцию индуцировали хорионическим гонадотропином (Московский эндокринный завод ФГУП, Россия) для запуска созревания ооцитов на 9-12 день после начала гормональной стимуляции яичников. Объектами исследования были образцы гранулезных клеток кумулюса, полученные во время пункции фолликулов во время процедуры ЭКО в Центре репродукции человека и ЭКО (Ростов-на-Дону). Библиотеки для секвенирования микроРНК были подготовлены с использованием набора для подготовки библиотеки РНК NEBNext Small для Illumina. Секвенирование РНК проводилось на платформе Miseq (Illumina). Контроль качества секвенирования проводился с использованием программ FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), удаление адаптеров проводили при помощи программы cutadapt (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/). Было выполнено картирование и подсчет количества прочтений с использованием программы STAR 2.7.9a с параметром outFilterMismatchNmax.  Далее для сборки транскриптов и оценки их уровня экспрессии использовался Cufflinks (https://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks). Экспрессию генов определяли количественно с использованием RPKM (reads per kilobase per million mapped reads — количество прочтений на килобазу на картированные риды) и показатель  tpm (transcripts per million).   На основании количества прочтений был установлен относительный уровень экспрессии микроРНК.

В работе использованы базы данных, которые  находится в открытом доступе miRBase (http://mirbase.org), miRDB (www.mirdb.org) и miRTarBase (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw).

Результаты исследований

В общей сложности в транскриптом анализе мы исследовали 2653 микро РНК, в гранулезных клетках человека.  Была  обнаружена транскрипция  247 микро РНК.   Учитывая, что количество сопоставленных прочтений зависит не только от уровня его экспрессии и длины гена, но и от глубины секвенирования, для нормализации этих зависимостей мы использовали показатель RPKM и показатель  tpm (transcripts per million).  TPM отражают относительную распространённость транскрипта среди популяции секвенированных транскриптонов и зависит от состава популяции РНК в образце.

Из 247 транскриптов микро РНК  в гранулезных клетках кумулюса мы представляем 30 микро РНК  с максимальными значениями tpm, как наиболее значимые (таблица 1). Как видно из результатов исследований   транскриптомный профиль зрелых miRNA  гранулезных клеток человека в кумулюсе (без учета родственных последовательностей) представлен следующими молекулами: hsa-miR-320; hsa-miR-21; hsa-miR-193; hsa-miR-1307; hsa-miR-10395; hsa-miR-127; hsa-let-7; hsa-miR-99; hsa-miR-744 hsa-miR-514; hsa-miR-629; hsa-miR 125; hsa-miR 140; hsa-miR 149; hsa-miR 181; hsa-miR-1291; hsa-miR 125; hsa-miR 151; hsa-miR 106; hsa-miR 365.  В этом перечне мы не уточняем зрелые мРНК которые различаются только в одной или двух позициях,  и им присваиваются буквенные суффиксы (например hsa-miR-320b и hsa-miR-320c), и  когда две разные зрелые последовательности микроРНК вырезаются из противоположных концов одного и того же предшественника шпильки и обозначаются hsa-miR-193b-3p(3′-конец) и hsa-miR-193b-5p (5′-конец). В таблице 1 представлены уникальные транскрибирующиеся  miRNA по номенклатуре  ID  miRBase (http://mirbase.org).

Таблица 1

Транскриптомный профиль miRNA в кумулюсных гранулезных клетках человека.

Как видно из представленных данных наибольшее число транскрибирующихся копий  в гранулезных клетках кумулюса приходится на  hsa-miR-320b (15679,8) и hsa-miR-320c (5945,8) и   hsa-miR-320a-3p (1576,7). Без учета родственных последовательностей hsa-miR-320 более  23200 tmp.   Родственные последовательности hsa-miR-320 локализованы на разных хромосомах  и отличаются друг от друга  одним нуклеотидом  (таблица 2).

Таблица 2

Локализация и последовательности зрелых микро РНКhsa-miR-320    

Поскольку одна микроРНК может воздействовать на несколько генов, а один ген может быть мишенью для нескольких микроРНК, мы использую базу данных  MicroRNA Target Prediction Database (miRDB, www.mirdb.org),  которая была разработана на основе анализа тысяч взаимодействий микроРНК с мишенями в ходе высокопроизводительных экспериментов по секвенированию,  стремились выявить любые общие пути взаимодействия hsa-miR-320 с белками мишенями.  В miRDB предсказано 1045 мишеней для hsa-miR-320b.  В том числе hsa-miR-320b  является мишенью для  35 белков с различными типами цинковых пальцев, 27 факторов  и субьединиц транскрипционных комплексов, 27 различных киназ,  17 мембранных белков,  5 циклинзависимых киназ, 5 факторов апоптоза  и др. (https://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi?searchType=miRNA&searchBox=hsa-miR-320b&full=1).  Для понимания в каких клеточных процессах принимает участие hsa-mir-320b , на основе данных полученных в 147 статьях, которые представлены в  открытом доступе и упоминают hsa-mir-320b  создано «облако слов» (рис.1).

Рис.1. «Облако слов»  созданное на основе  147 статей, которые представлены в  открытом доступе и упоминают hsa-mir-320b  (https://www.mirbase.org/hairpin/MI0003776).

Как видно из представленного «облака слов»  hsa-mir-320b  принимает участие  в пролиферации, в сигнальных путях, в том числе и пути WNT,  наиболее часто встречается в работах где исследуется процессы онкогенеза, в частости колоректальный  рак (CRC),  есть единичные работы  о его роли в функционировании яичника и фолликула, анализ работ показывает, что достаточно часто hsa-mir-320b  экспрессируется с родственными последоватльностями 320а, 320d.  

Ранее было показано, что результате наиболее распространёнными микроРНК в кумулюсных клетках оказались let-7b, let-7c и hsa-mir-21 (Assou, S.;2014). В наших исследованиях транскптома гранулезных клеток кумулюса также отмечена  их значительная экспрессия (таблица 1). hsa-miR-21-3p локализована на 17 хромосоме и для нее предсказано 595 мишеней (https://www.mirbase.org/results/?query=hsa-miR-21). «Облако слов» созданное на основе 1559 статей, в которых исследована hsa-mir-21, показывает, что эта молекула  играет решающую  роль в регуляции апоптоза и роста организмов, а также ассоциирована  с подавлением опухолей (рис.2). В единичных работах приводятся данные о том , что  miR-21-3p влияет на аутофагию  гранулезных клеток (у крупного рогатого скота), как показали Ма и др., воздействуя на VEGFA и ослабляя передачу сигналов PI3K/AKT, что приводит к ингибированию аутофагии (Ma, L., 2019).

Семейство let-7 - это высококонсервативное семейство микроРНК, играющее важную роль в развитии, дифференцировке, метаболизме, пролиферации и апоптозе у многих видов. МикроРНК let-7, впервые обнаруженная у нематоды C. elegans, является ключевым регулятором развития и участвует в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Семейство let-7 у человека состоит из 13 членов (Roush and Slack, 2008). Семейство hsa-let-7 дифференциально экспрессируется во время атрезии фолликулов (Su, J et al., 2012: Gong Z. et al., 2019). уровни экспрессии генов mir-let-7a, let-7b, let-7c и let-7i были снижены в ранних и прогрессирующих атретических фолликулах по сравнению со здоровыми фолликулами (Zhou, j., 2015). показано, что  let-7g регулирует апоптоз гранулезных клеток воздействуя на TGFBR1 и подавляя сигнальный путь TGF-Β  ( J Zhou, 2015).  

Рис.2. «Облако слов» созданное на основе 1559 статей, в которых исследована hsa-mir-21 (https://www.mirbase.org/hairpin/MI0000077).

Сверхэкспрессия mir-let-7g повышала уровень апоптоза в  гранулезных клетках  мышей  и экспрессию FOXO1 в  гранулезных клетках, что привело к накоплению дефосфорилированного FOXO1 в ядре (Cao R.,et al., 2015).   В таблице 3  Транскриптомный профиль 11 микроРНК семейства  hsa-let-7, который был определен в наших исследованиях в кумулюсных гранулезных клетках человека. Повышенная экспрессия miRNA let-7 в фолликулярном микроокружении яичников и влияет на экспрессию рецептора инсулиноподобного фактора роста 1-го типа (IGF1R) в клетках гранулезы,  нарушаяя их пролиферацию, уровень секреции стероидных гормонов, энергетический метаболизм аденозинтрифосфата  и уровень окислительного стресса, вызванного активными формами кислорода (Shi, L.,2025). Также показано, что hsa-let-7  регулирует экспрессию рецептора эстрогена (Zhang, R.,2012). Транскриптомный профиль семейства  hsa-let-7a в кумулюсных гранулезных клетках человека представлен в таблице 3.

Таблица 3

Транскриптомный профиль семейства  hsa-let-7a в кумулюсных гранулезных клетках человека.

Как видно из таблицы 3 из 13 членов семейства hsa-let-7, 11 транскриптов  микро РНК было обнаружено в гранулезных клетках кумулюса здоровых женщин.  Для hsa-let-7a-5p  в каталоге  miRDB предсказано 990 мишеней. Из них 15 белков различных рецепторов, 9 белков -факторов роста а, 8 факторов транскрипции, 8 различных семейств  белков переносчиков,5 белков в различных гомеобксах.   На рисунке 3  представлено «облако слов» биологических процессов,  созданное на основе 1270 статей, в которых исследована hsa-let-7а (https://www.mirbase.org)

В работах китайских ученых была исследована роль микроРНК в клетках гранулезы яичников в норме и при заболеваниях. Ими отмечено 10 наиболее распространённых микроРНК в муральных  гранулезных клетках и  гранулезных клетках кумулюса:   miR-21-5p,  let-7a-5p, let-7f-5p, miR-26a-5p, let-7b-5p, let-7g-5p, miR-103a-3p, miR-125a-5p, miR-92a-3p, miR-320a и другие микроРНК (Tu, J.,2019).  Как видно из таблицы1 микро РНК семейства let-7 miR-21-5p,  miR-320a miR-125a-5p имеют пересечение с траскриптомным профилем микро РНК в гранулезных клетках  полученном в нашем исследовании и исследовании китайских ученых.

Рис. 3. «Облако слов» биологических процессов,  созданное на основе1270   статей, в которых исследована hsa-let-7а (https://www.mirbase.org)

Заключение.

Многие микроРНК экспрессируются в гранулезных клетках и напрямую регулируют нормальное развитие и функционирование фолликулов яичников.  Одна микроРНК может подавлять сотни, даже тысячи генов, а один ген может модулироваться несколькими микроРНК. Наше исследование позволяет получить ценные сведения о транскриптоме и регуляторных механизмах транскрипции в ооцитах и клетках кумулюса.  В этом исследовании мы оценивали только транскрипционный профиль клеток кумулюса, непосредственно окружающих ооцит. Эти клетки кумулюса играют ключевую роль на заключительных стадиях созревания ооцита, напрямую контактируя с ооцитом и доставляя метаболические субстраты. Выявление микроРНК, специфичных для гранулезных клеток, поможет исследователям лучше понять механизмы, лежащие в основе заболеваний яичников.

Финансирование

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 23–15-00464.

Список литературы

1. Аушев В. Н. МикроРНК: малые молекулы с большим значением //Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. – 2015. – Т. 8. – №. 1. – С. 1-12.
2. Кучер А. Н., Бабушкина Н. П. Роль микро-РНК, генов их биогенеза и функционирования в развитии патологических состояний у человека //Медицинская генетика. – 2011. – Т. 10. – №. 1. – С. 3-13.
3. Мустафин, Р. Н., & Хуснутдинова, Э. К. (2025). Взаимосвязь мобильных генетических элементов с некодирующими РНК в развитии атеросклероза (обзор). Научные результаты биомедицинских исследований, 11(1), 31-56.
4. Омельчук, Е. П., Тимошкина, Н. Н., Росторгуев, Э. Е., & Дженкова, Е. А. (2024). Циркулирующие биомаркеры глиом (обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика, 69(8), 411-20.
5. Albertini DF, Combelles CM, Benecchi E, Carabatsos MJ (2000) Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development. Reproduction 121: 647–653.
6. Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature, 431(7006), 350-355.
7. Assou S, Anahory T, Pantesco V, Le Carrour T, Pellestor F, et al. (2006) The human cumulus – oocyte complex gene-expression profile. Hum Reprod 21: 1705–1719.
8. Assou, S.; Al-Edani, T.; Haouzi, D.; Philippe, N.; Lecellier, C.H.; Piquemal, D.; Commes, T.; Aït-Ahmed, O.; Dechaud, H.; Hamamah, S. MicroRNAs: New candidates for the regulation of the human cumulus-oocyte complex. Reprod. 2013, 28, 3038–3049.
9. Adriaenssens T, Segers I, Wathlet S, Smitz J (2011) The cumulus cell gene expression profile of oocytes with different nuclear maturity and potential for blastocyst formation. J Assist Reprod Genet 28: 31–40.
10. Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. cell, 116(2), 281-297.
11. Cao R., Wu, W. J., Zhou, X. L., Xiao, P., Wang, Y., & Liu, H. L. Expression and preliminary functional profiling of the let-7 family during porcine ovary follicle atresia //Molecules and cells. – 2015. – Т. 38. – №. 4. – С. 304-311.
12. Cheng, Y., Liu, X., Zhang, S., Lin, Y., Yang, J., & Zhang, C. (2009). MicroRNA-21 protects against the H2O2-induced injury on cardiac myocytes via its target gene PDCD4. Journal of molecular and cellular cardiology, 47(1), 5-14.
13. Cui, Y., Qi, Y., Ding, L., Ding, S., Han, Z., Wang, Y., & Du, P. (2024). miRNA dosage control in development and human disease. Trends in Cell Biology, 34(1), 31-47.
14. Dompe, C., Kulus, M., Stefańska, K., Kranc, W., Chermuła, B., Bryl, R., ... & Kempisty, B. (2021). Human granulosa cells—stemness properties, molecular cross-talk and follicular angiogenesis. Cells, 10(6), 1396.
15. Erson, A. E., & Petty, E. M. (2008). MicroRNAs in development and disease. Clinical genetics, 74(4), 296-306
16. Gong, Z., Yang, J., Bai, S., & Wei, S. (2019). MicroRNAs regulate granulosa cells apoptosis and follicular development—A review. Asian-Australasian journal of animal sciences, 33(11), 1714.
17. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., & Enright, A. J. (2006). miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic acids research, 34(suppl_1), D140-D144.
18. Kozomara, A., Birgaoanu, M., & Griffiths-Jones, S. (2019). miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic acids research, 47(D1), D155-D162.
19. Ma, L., Zheng, Y., Tang, X., Gao, H., Liu, N., Gao, Y., ... & Jiang, Z. (2019). miR-21-3p inhibits autophagy of bovine granulosa cells by targeting VEGFA via PI3K/AKT signaling. Reproduction, 158(5), 441-452.
20. Roush S., Slack F. J. The let-7 family of microRNAs //Trends in cell biology. – 2008. – Т. 18. – №. – С. 505-516.
21. Searles, C. D. (2024). MicroRNAs and cardiovascular disease risk. Current Cardiology Reports, 26(2), 51-60.
22. Sayed, D., & Abdellatif, M. (2011). MicroRNAs in development and disease. Physiological reviews, 91(3), 827-887.
23. Sekar, D., Venugopal, B., Sekar, P., & Ramalingam, K. (2016). Role of microRNA 21 in diabetes and associated/related diseases. Gene, 582(1), 14-18.
24. Shang, R., Lee, S., Senavirathne, G., & Lai, E. C. (2023). microRNAs in action: biogenesis, function and regulation. Nature Reviews Genetics, 24(12), 816-833.
25. Shi, L., Ying, H., Dai, Y., Rong, Y., Chen, J., Zhou, F., ... & Zhang, S. (2025). Upregulated let-7 expression in the follicular fluid of patients with endometriomas leads to dysfunction of granulosa cells through targeting of IGF1R. Human Reproduction, 40(1), 119-137.
26. Su, J. L., Chen, P. S., Johansson, G., & Kuo, M. L. (2012). Function and regulation of let-7 family microRNAs. Microrna, 1(1), 34-39.
27. Tong, X. H., Xu, B., Zhang, Y. W., Liu, Y. S., & Ma, C. H. (2014). Research resources: comparative microRNA profiles in human corona radiata cells and cumulus oophorus cells detected by next-generation small RNA sequencing. PLoS One, 9(9), e106706.
28. Tu, J., Cheung, A. H. H., Chan, C. L. K., & Chan, W. Y. (2019). The role of microRNAs in ovarian granulosa cells in health and disease. Frontiers in endocrinology, 10, 174.
29. Zhang, R., He, Y., Zhang, X., Xing, B., Sheng, Y., Lu, H., & Wei, Z. (2012). Estrogen receptor-regulated microRNAs contribute to the BCL2/BAX imbalance in endometrial adenocarcinoma and precancerous lesions. Cancer letters, 314(2), 155-165.
30. Zhou, J., Liu, J., Pan, Z., Du, X., Li, X., Ma, B., ... & Liu, H. (2015). The let-7g microRNA promotes follicular granulosa cell apoptosis by targeting transforming growth factor-β type 1 receptor. Molecular and Cellular Endocrinology, 409, 103-112.

Статья поступила в редакцию 18 марта 2025 г.

Принята к печати 28 марта 2025 г.

Received 18, March, 2025

Accepted 28, March, 2025