Индуцированная IL-17A, TNF и IL-10 дифференцировка NK-клеток при злокачественных новообразованиях молочной железы

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) остается одной из наиболее распространенных и социально значимых форм онкологических заболеваний. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (World Health Organization, WHO, 2023), РМЖ занимает первое место по заболеваемости среди всех злокачественных новообразований у женщин, с ежегодной регистрацией более 2,2 миллиона новых случаев и смертностью, превышающей 685 000 человек в год (Elaraby et al., 2024). В России, по данным национального канцер-регистра (2023 г.), зафиксировано более 75 000 новых случаев РМЖ, а смертность достигла 21 634 человек (Каприн А.Д., 2024). Несмотря на прогресс в ранней диагностике и внедрении таргетной терапии, высокая частота рецидивов и развитие резистентности к лечению остаются ключевыми проблемами в клинической онкологии (Byemerwa J. et al., 2025). В связи с этим особую актуальность приобретает исследование механизмов противоопухолевого иммунитета, в частности, роли натуральных киллерных клеток (NK-клеток) в контроле опухолевого роста. 

NK-клетки представляют собой важный компонент врожденного и адаптивного иммунитета, обладающий способностью распознавать и уничтожать трансформированные клетки без предварительной сенсибилизации (Li F. et al., 2022). Их функциональная активность регулируется сложным балансом активирующих и ингибирующих рецепторов, а также цитокиновой средой (Elanany M.M. et al., 2023). По уровню экспрессии кластеров дифференцировки CD56 и CD16 выделяют две основные субпопуляции NK-клеток – CD56^hiCD16^low и CD56^lowCD16^hi, которые играют важную роль в противоопухолевом иммунном ответе. CD56^hiCD16^low клетки преимущественно продуцируют широкий спектр цитокинов, а CD56^lowCD16^hi – обладают высокой цитотоксической активностью (Rezaeifard S. et al., 2021). Дисбаланс CD56^hiCD16^low / CD56^lowCD16^hi субпопуляций и их функциональное состояние при РМЖ могут определять эффективность противоопухолевого ответа (Rezaeifard S. et al., 2021). 

Медиаторы иммунной системы - цитокины играют ключевую роль в регуляции дифференцировки и функциональной активности NK-клеток. С прогрессированием РМЖ и функциональным состоянием NK-клеток коррелируют уровни IL-17A, TNF-α и IL-10 (Demir A. et al., 2021). IL-17A, продуцируемый Th17-хелперами и NK-клетками, стимулиет выработку IFN-γ, что способствует активации цитотоксических рецепторов NKG2D, NKp30 и NKp46 (Yang S. et al., 2024). При РМЖ повышенный уровень IL-17A ассоциирован с агрессивным фенотипом опухоли (Chen et al., 2023). TNF-α, в свою очередь, усиливает цитотоксичность NK-клеток через активацию рецепторов смерти TRAIL, однако его избыточная продукция в опухолевом микроокружении может способствовать хроническому воспалению и иммуносупрессии (Cardoso Alves L. et al., 2021).

Особый интерес представляет двойственная роль IL-10 при РМЖ, который, с одной стороны, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов (IFN-γ, TNF-α, IL-12), необходимых для активации NK-клеток. Но в условиях хронического воспаления, IL-10 может стимулировать пролиферацию NK-клеток. Клинические данные свидетельствуют о том, что повышенный уровень IL-10 в опухолевом микроокружении коррелирует с дисфункцией NK-клеток и неблагоприятным прогнозом течения заболевания (Chang C.M. et al., 2021). 

Таким образом, изучение влияния IL-17A, TNF-α и IL-10 на дифференцировку и функциональные свойства NK-клеток при РМЖ представляет значительный научный и клинический интерес. Исследование этих механизмов может способствовать разработке новых стратегий адоптивной иммунотерапии, направленных на модуляцию цитокинового микроокружения и усиление противоопухолевой активности NK-клеток.

Цель исследования: проанализировать in vitro влияние IL-10, IL-17A и TNF-a на баланс CD56^hiCD16^low / CD56^lowCD16^hi субпопуляций NK-клеток у пациенток с гистологически верифицированным диагнозом РМЖ.

Материал и методы исследования

Исследование проведено на базе иммуногенетической лаборатории Адыгейского государственного университета. Образцы крови пациенток с раком молочной железы (РМЖ, n=30) предоставлены Адыгейским республиканским онкологическим диспансером им. М.Х. Ашхамафа (г. Майкоп). Контрольную группу (n=30) составили здоровые доноры, проживающие в Республике Адыгея, без клинических проявлений РМЖ (подтверждено анкетированием, осмотром и медицинским обследованием).

Критерии включения пациенток с РМЖ: гистологически или цитологически подтвержденная аденокарцинома молочной железы (местно-распространенная или метастатическая); возраст старше 18 лет; подписанное информированное согласие.

Критерии исключения: системное лечение РМЖ в неоадъювантном/адъювантном режиме с безрецидивным интервалом <12 месяцев; другие злокачественные новообразования в анамнезе (последние 5 лет); использование атрациклинов в кумулятивных дозах; тяжелые сопутствующие патологии (неконтролируемая гипертензия, нестабильная стенокардия, инфаркт миокарда в последние 6 месяцев); острые состояния (хирургические вмешательства, травмы в течение 28 дней); беременность, лактация; инфекции (ВИЧ, гепатиты B/C); активные воспалительные процессы.

Исследование соответствовало Хельсинкской декларации (2000 г.) и Приказу Минздрава РФ №266 от 19.06.2003. Все участники предоставили информированное согласие.

Методы лабораторного анализа

Забор крови у доноров и пациентов проведен утром натощак. Мононуклеарные клетки (МНК) выделены из периферической крови на градиенте фиколла («Histopaque», плотность 1.077). Клетки подсчитаны на автоматическом счетчике Countess 3 FL (Thermo Scientific, США), ресуспендированы в культуральной среде до концентрации 2–5×10⁶ клеток/мл. Суспензию клеток инкубировали 18 часов в CO₂-инкубаторе (37°C, 5% CO₂, влажность 80%). Стимуляцию проводили ФГА (5 мг/мл), IL17A, TNF-a и IL-10 (по 50 пг/мл). Иммунофенотипирование МНК выполняли на цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter, США) с антителами к CD3, CD16 и CD56.

Статистическая обработка данных

Статистический анализ результатов экспериментальных исследований проведен в строгом соответствии с актуальными принципами и рекомендациями SAMPL, с использованием Microsoft Excel (Excel 2019, Microsoft, Redmond, WA, США) и пакета статистического программного обеспечения IBM SPSS Statistics Version 17.0 (IBM Corporation, США). Тип распределения количественных данных определен с помощью теста Шапиро-Уилка. Для данных с нормальным распределением рассчитаны средние значения со стандартным отклонением (M±SD). Для попарного сравнения исследуемых групп применяли t-критерий Стьюдента. Статистическая значимость различий определена при уровне p <0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате исследования установлено, что количество цитокинпродуцирующих CD56^hiCD16^low и цитотоксических CD56^lowCD16^hi NK-клеток было достоверно выше в группе больных РМЖ (p=0,007 и p<0,0001 соответственно, таблица 1). При анализе распределения CD56^hiCD16^low / CD56^lowCD16^hi субпоппуляций у здоровых доноров выявлено достоверно значимое преобладание CD56^hiCD16^low NK-клеток над цитотоксическими (p=0,02), тогда как у больных РМЖ достоверных различий между исследуемыми субпопуляциями не установлено (p=0,37). Увеличение количества регуляторных CD56^hiCD16^low NK-клеток, по данным Fontaine A. et al., отражает способность иммунной системы активировать противоопухолевый ответ оверэкспрессией INF-γ (Fontaine A. et al., 2024). Однако, при прогрессировании РМЖ, NK-клетки часто теряют свою функциональную активность под влиянием иммуносупрессивного микроокружения опухоли (Salemme V. et al., 2021). Отсутствие достоверных различий между субпопуляциями NK-клеток у больных РМЖ может быть обусловлено функциональным истощением цитотоксических NK-клеток, а также гиперактивацией CD56^hiCD16^low субпопуляции под действием иммуносупрессивных цитокинов, таких как IL-10 и TGF-β (Salemme V. et al., 2021). Demir A. et al. (2024) установлено, что пролиферация CD56^lowCD16^hi субпопуляции NK-клеток ассоциирована с лучшим ответом на иммунотерапию, а преобладание CD56^hiCD16^low субпопуляции сопряжено с более агрессивным течением заболевания.

Таблица 1. Соотношение CD3^-CD56^HiCD16^Low/CD3^-CD56^LowCD16^Hi субпопуляций NK-клеток у больных РМЖ и доноров

Примечание: t – критерий Стьюдента; p – уровень значимости; * – статистически значимо; % - процент от общего числа лейкоцитов; t, p1 – между донорами и больными; t, p2 – между CD56^HiCD16^low и CD16^HiCD56^low субпопуляциями.

Перспективным направлением исследований представляется изучение возможностей коррекции дисбаланса NK-клеточных субпопуляций посредством модуляции цитокинового микроокружения опухолевых узлов. Для оценки сочетанного влияния растительных митогенов и спектра цитокинов на соотношение субпопуляций NK у больных РМЖ, in vitro проведено исследование на МНК больных РМЖ. Установлено, что ФГА (в конечной концентрации 5 мг/мл в питательной среде) вызывает статистически значимое превышение регуляторной субпопуляции CD56^hiCD16^low NK-клеток (15,49±2.89%, p=0,03) без существенного влияния на цитотоксические CD56^lowCD16^hi - клетки (5,47±1,47%, p=0,9). Эти результаты согласуются с исследованиями Rahimian L. et al. (2022), подтверждающими способность растительных лектинов избирательно активировать определенные субпопуляции МНК.

IL-17A (в конечной концентрации 50 пг/мл в питательной среде), незначительно увеличивал долю CD56^hiCD16^low клеток (12,31±2,12%, p=0,2011) при одновременном снижении цитотоксической CD56^lowCD16^hi субпопуляции (3,11±0,78%, p=0,0001). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что IL-17A при хроническом воспалении может способствовать поляризации иммунного ответа – смещению пула NK к регуляторному фенотипу (Hum N. R. et al., 2022). Однако механизмы избирательного действия цитокинов, в частности IL-17A, на субпопуляции NK-клеток не изучены и требуют дополнительных исследований, включая анализ экспрессии рецепторных субъединиц к IL-17 на поверхности NK-клеток (Hum N. R. et al., 2022).

Инкубация МНК с TNF-а (в конечной концентрации 50 пг/мл в питательной среде) не оказывала существенного стимулирующего эффекта на CD56^hiCD16^low субпопуляцию (11,67±1,44%, p=0,22), но при этом достоверно активировала цитотоксические CD56^lowCD16^hi NK-клетки (9,21±2,41%, p=0,02). Эти данные согласуются с исследованиями Razeghian E. et al. (2022) о роли TNF-а в активации цитотоксического потенциала NK-клеток посредством усиления экспрессии цитотоксических белков - перфоринов и гранзимов. Однако более поздние исследования, подтвердили стимулирующее влияние TNF-а как на регуляторные CD56^hiCD16^low, так и цитотоксические CD56^lowCD16^hi субпопуляции NK-клетки (Razeghian E. et al., 2022).

IL-10 (в конечной концентрации 50 пг/мл), в отличии от других медиаторов иммунной системы, оказывал разнонаправленное влияние на две субпопуляции NK: незначительно стимулируя пролиферацию CD56^hiCD16^low клеток (12,47±2,68%), одновременно подавлял количество цитотоксических CD56^lowCD16^hi лимфоцитов (2,74±0,74%, p=0,04) у больных РМЖ. Эти результаты согласуются с данными Chang C. M. et al. (2021), подтвердившими иммуносупрессивное действие IL-10 на цитотоксическую активность NK-клеток при РМЖ, но наблюдаемый нами эффект IL-10 был более выражен, чем в аналогичных исследованиях.

Таблица 2. Влияние in vitro растительного митогена ФГА и цитокинов на баланс CD56^HiCD16^low и CD16^HiCD56^low субпопуляций натуральных киллеров при РМЖ

Примечание: t – критерий Стьюдента; p – уровень значимости; * – статистически значимо t, p¹ – между интактными и стимулированными NK-клетками; t, p² – между CD56^HiCD16^low и CD16^HiCD56^low субпопуляциями

Сравнительный анализ действия ФГА, IL-10 IL-17A и TNF-а предполагает существование различных механизмов регуляции пролиферации и баланса субпопуляций NK-клеток при РМЖ. ФГА и основной провоспалительный медиатор первой волны IL-17A преимущественно стимулируют регуляторную субпопуляцию, что соответствует концепции «иммунного переключения» при опухолевой прогрессии РМЖ (Morvan et al., 2022). С другой стороны TNF-а, несмотря на разнонаправленные эффекты, активируя преимущественно цитотоксические NK-клетки и усиливая противоопухолевый иммунитет, может быть использован в адоптивной иммунотерапии (Razeghian E. et al., 2022).

IL-10, оказывающий двунаправленное действие на эффекторные клетки иммунной системы, может играть ключевую роль и в формировании иммуносупрессивного микроокружения опухоли (Chang C. M. et al., 2021).

Клиническое значение полученных результатов для регуляции баланса эффекторов врожденного и адоптивного иммунитета заключается в возможности использования выявленных закономерностей для разработки новых подходов к иммунотерапии ЗНО, включая РМЖ. В частности, комбинированное применение TNF-а с ингибиторами IL-10 может представлять собой перспективную стратегию коррекции in vitro дисбаланса NK-клеточных субпопуляций у пациенток с РМЖ.

Заключение

Полученные результаты демонстрируют существенные изменения в соотношении NK-клеточных субпопуляций у пациенток с РМЖ, проявляющиеся значительным увеличением как цитокинпродуцирующих CD56^hiCD16^low, так и цитотоксических CD56^lowCD16^hi клеток по сравнению со здоровыми донорами. Проведенные in vitro исследования подтвердили влияние различных иммуномодуляторов на фенотип NK-клеток. Эти данные могут иметь важное теоретическое и практическое значение, поскольку не только углубляют представление о механизмах регуляции NK-клеточного ответа при ЗНО, но и открывают новые перспективы для разработки прогностических маркеров и персонализированных подходов к экстракорпоральной адоптивной иммунотерапии.

Список литературы

МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. М.; 2021. 252 с.

Byemerwa J., Chang C. Y., McDonnell D. P. The Roles of Natural Killer Cells in Breast Cancer Pathobiology and their Regulation by Estrogens //Endocrine Reviews. – 2025. – С. bnaf014.

Cardoso Alves L. et al. The multifaceted role of TRAIL signaling in cancer and immunity //The FEBS journal. – 2021. – Т. 288. – №. 19. – С. 5530-5554.

Chang C. M. et al. Interleukin-10: A double-edged sword in breast cancer //Tzu chi medical journal. – 2021. – Т. 33. – №. 3. – С. 203-211.

Demir A. et al. Blood Cytokine Profile in Breast Cancer: Focusing on Differences among Molecular Subtypes //Iranian Journal of Immunology. – 2024. – Т. 21. – №. 4. – С. 316-327.

Elanany M. M., Mostafa D., Hamdy N. M. Remodeled tumor immune microenvironment (TIME) parade via natural killer cells reprogramming in breast cancer //Life sciences. – 2023. – Т. 330. – С. 121997.

Fontaine A. Tumor microenvironment heterogeneity and novel therapeutic approaches in pleural mesothelioma. – 2024.

Hum N. R. et al. IL-17A increases doxorubicin efficacy in triple negative breast cancer //Frontiers in Oncology. – 2022. – Т. 12. – С. 928474.

Li F., Liu S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer //Frontiers in Immunology. – 2022. – Т. 13. – С. 1083462.

Rahimian L. et al. Reduced expression of natural killer cell-related activating receptors by peripheral blood mononuclear cells from patients with breast cancer and their improvement by zoledronic acid //Asian Pacific Journal of Cancer Prevention: APJCP. – 2022. – Т. 23. – №. 5. – С. 1661.

Razeghian E. et al. The role of the natural killer (NK) cell modulation in breast cancer incidence and progress //Molecular Biology Reports. – 2022. – Т. 49. – №. 11. – С. 10935-10948.

Rezaeifard S. et al. Tumor infiltrating NK cell (TINK) subsets and functional molecules in patients with breast cancer //Molecular Immunology. – 2021. – Т. 136. – С. 161-167.

Salemme V. et al. The crosstalk between tumor cells and the immune microenvironment in breast cancer: implications for immunotherapy //Frontiers in oncology. – 2021. – Т. 11. – С. 610303.

Yang S. et al. An estrogen–NK cells regulatory axis in endometriosis, related infertility, and miscarriage //International Journal of Molecular Sciences. – 2024. – Т. 25. – №. 6. – С. 3362.

Reference

Byemerwa J., Chang C. Y., McDonnell D. P. The Roles of Natural Killer Cells in Breast Cancer Pathobiology and their Regulation by Estrogens //Endocrine Reviews. – 2025. – С. bnaf014.

Cardoso Alves L. et al. The multifaceted role of TRAIL signaling in cancer and immunity //The FEBS journal. – 2021. – Т. 288. – №. 19. – С. 5530-5554.

Chang C. M. et al. Interleukin-10: A double-edged sword in breast cancer //Tzu chi medical journal. – 2021. – Т. 33. – №. 3. – С. 203-211.

Demir A. et al. Blood Cytokine Profile in Breast Cancer: Focusing on Differences among Molecular Subtypes //Iranian Journal of Immunology. – 2024. – Т. 21. – №. 4. – С. 316-327.

Elanany M. M., Mostafa D., Hamdy N. M. Remodeled tumor immune microenvironment (TIME) parade via natural killer cells reprogramming in breast cancer //Life sciences. – 2023. – Т. 330. – С. 121997.

Fontaine A. Tumor microenvironment heterogeneity and novel therapeutic approaches in pleural mesothelioma. – 2024.

Hum N. R. et al. IL-17A increases doxorubicin efficacy in triple negative breast cancer //Frontiers in Oncology. – 2022. – Т. 12. – С. 928474.

Li F., Liu S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer //Frontiers in Immunology. – 2022. – Т. 13. – С. 1083462.

P.A. Hertsen Moscow Oncology Research Institute – Branch of the National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation. Malignant Neoplasms in Russia in 2020 (Morbidity and Mortality) / ed. by A.D. Kaprin, V.V. Starinsky, A.O. Shakhzadova. — Moscow; 2021. — 252 p.

Rahimian L. et al. Reduced expression of natural killer cell-related activating receptors by peripheral blood mononuclear cells from patients with breast cancer and their improvement by zoledronic acid //Asian Pacific Journal of Cancer Prevention: APJCP. – 2022. – Т. 23. – №. 5. – С. 1661.

Razeghian E. et al. The role of the natural killer (NK) cell modulation in breast cancer incidence and progress //Molecular Biology Reports. – 2022. – Т. 49. – №. 11. – С. 10935-10948.

Rezaeifard S. et al. Tumor infiltrating NK cell (TINK) subsets and functional molecules in patients with breast cancer //Molecular Immunology. – 2021. – Т. 136. – С. 161-167.

Salemme V. et al. The crosstalk between tumor cells and the immune microenvironment in breast cancer: implications for immunotherapy //Frontiers in oncology. – 2021. – Т. 11. – С. 610303.

Yang S. et al. An estrogen–NK cells regulatory axis in endometriosis, related infertility, and miscarriage //International Journal of Molecular Sciences. – 2024. – Т. 25. – №. 6. – С. 3362.

Статья поступила в редакцию 12 марта 2025 г.

Принята к печати 28 марта 2025 г.

Received 12, March, 2025

Accepted 28, March, 2025