Биоинформационный поиск генов микроРНК и днРНК вокруг генов, участвующих в патогенезе синдрома поликистоза яичников у человека

Введение

Генетические, экологические и эпигенетические факторы играют важную роль в патогенезе синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), однако этиология СПКЯ остается неясной. Синдром поликистозных яичников регистрируется у более чем 10 % женщин репродуктивного возраста и представляет собой одну из самых распространенных причин бесплодия (Калугина А.С., Бобров К.Ю., 2015; Адамян Л.В. и др., 2022).

Гиперандрогения, поликистоз яичников, хроническая ановуляция и метаболические нарушения являются общими чертами СПКЯ. Синдром поликистозных яичников — гетерогенное заболевание, анализ 23 полногеномных ассоциативных исследований (GWAS) выявил 95 локусов различных генов, при этом их роль в патогенезе заболевания в значительной степени остается неизвестна (https://www.ebi.ac.uk/gwas/efotraits/EFO_0000660). Проведены обширные исследования молекулярно-генетических причин СПКЯ, в которых основное внимание уделялось генам, участвующим в важнейших физиологических путях, таких как стероидогенез, сигнальные пути инсулина и регуляция окислительного стресса (Welt CK, 2021; Ali R.M. et al., 2023; Азизова Г.Д., 2023; Bulanov I. et al., 2023). Изучение генетических факторов СПКЯ привело к пониманию многогранной природы этого заболевания. В последние десятилетия ведется интенсивный поиск генов некодирующей РНК, участвующих в развитии СПКЯ. Показана значимая дифференциальная экспрессия генов некодирующих РНК в сыворотке крови, гранулезных клетках, фолликулярной жидкости и других тканях между пациентами с СПКЯ и без СПКЯ (Zhao J. et al.,2019; Mu L. et al.,2021; Tu M. et al., 2022).

Целью данного исследования было выявление локализации длинной некодирующей РНК (днРНК) и микроРНК, а также однонуклеотидных полиморфизмов в генах днРНК и микроРНК в цис-регуляторных районах генов, вовлеченных в процесс фолликулогенеза, для понимания их роли в молекулярной патофизиологии СПКЯ.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили последовательности ДНК человека. Использовали сборку генома GRCh37/hg19. Перечень изучаемых генов был составлен на основе анализа научных публикаций (Петров И.А. и др., 2017; Боярский К.Ю., Кахиани Е.И., 2018; Марченко Л.А. и др., 2020; Зенкина В.Г. и др., 2022; Соколова Ю.В. и др., 2022).

Поиск функциональных элементов (генов днРНК, микроРНК, сайтов связывания микроРНК, GWAS вариантов в генах днРНК, микроРНК и сайтах их связывания) проводили при помощи геномного браузера UCSC. Использовали следующую конфигурацию треков:

Genes and Gene Predictions

- UCSC Genes = pack

- NCBI RefSeq = pack

- sno/miRNA = pack

Phenotype and Literature

- GWAS Catalog = pack

- OMIM Genes = dense

mRNA and EST

- Human ESTs = pack

- Human mRNAs = pack

Expression

- GTEx Gene V8 = pack

- GTEx Gene = pack

Regulation

- ENCODE Regulation = show

- TS miRNA Targets = show

Variation

- dbSNP 155 = hide

Критерии включения функциональных элементов: находится в области гена или его ближайшем окружении (до 1000 п.н.), экспрессируется в яичнике.

Результаты

К ключевым процессам в гранулезных клетках можно отнести следующие: связывание с рецепторами гормонов (ФСГ, ЛГ, АМГ), активация сигнальных путей PI3K-AKT-Foxo3a и PI3K-AKT-mTORС1, синтез ароматазы. Всего было изучено 33 гена, принимающих участие в вышеперечисленных процессах, в последовательности и ближайшем генном окружении которых выявлено 20 днРНК, из них 17 антисмысловых, 4 гена микроРНК в интронах, сайты связывания 121 микроРНК. Результаты представлены в таблице 1. Также было обнаружено 16 полиморфных локусов внутри генов днРНК, ассоциированных с различными патологиями по данным GWAS исследований. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 1 - Гены днРНК, микроРНК и сайты их связывания, локализованные вокруг генов, участвующих в патогенезе СПКЯ

Таблица 2 - Полиморфные локусы генов днРНК и их ассоциация с мультифакторными заболеваниями по данным GWAS

Обсуждение

Выявление потенциальных таргетных генов гранулезных клеток при СПКЯ является сложной задачей. Одним из подходов к поиску генов-кандидатов может являться биоинформационный поиск днРНК и микроРНК, расположенных в цис-регуляторных областях генов, контролирующих основные клеточные процессы, отвечающие за поддержание ее специфичной функции.

Анализ полиморфных вариантов генов днРНК показал, что из 16 SNP, обнаруженных внутри генов днРНК, локализованных вокруг генов, специфичных для гранулезных клеток, 4 оказались ассоциированы с репродуктивной функцей по данным полногеномных исследований. Два полиморфных локуса ассоциированы с характеристиками менструального цикла: rs471811 внутри днРНК PGR-AS1 связан с продолжительностью менструального цикла, а rs182498797, расположенный внутри днРНК ENSG00000287848, – с возрастом менархе. Два полиморфизма - ENSG00000287848 rs77503049 и ENSG00000272114 rs1570360 – ассоциированы с уровнем глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ).

Пять аллелей были ассоциированы с процессами либо морфологическими характеристиками, характерными для ожирения, которое часто является коморбидным состоянием при поликистозе яичников. Так, полиморфизм rs375825314 в днРНК PGR-AS1 влияет на обмен лактона, rs1893154 в днРНК ENSG00000265179 ассоциирован с морфологическими характеристиками, характерными для ожирения,  кs2791643 в днРНК MTOR-AS1 связан с индексом массы тела, кs2791644 в днРНК EXOSC10-AS1 коррелирует с соотношением талии к бедрам, rs10490120 в днРНК TCONS_l2_00014567 связан с уровнями липопротеинов низкой плотности и холестерина.

Замены нуклеотидов в днРНК способны изменять ее вторичную и третичную структуру, что сказывается на функциональности днРНК. Так как обнаруженные полиморфные локусы в днРНК оказались ассоциированы с репродуктивной функцией, это указывает на возможное функциональное значение этих днРНК в патогенезе СПКЯ.

Внутри интрона гена рецептора фолликулостимулирующего гормона (FSHR) обнаружен ген микроРНК hsa-miR-548ba. Данная микроРНК экспрессируется в гранулезных клетках, среди ее мишеней - гены PTEN и LIFR, которые необходимы для активации и роста фолликулов яичников. Характер экспрессии hsa-miR-548ba коррелирует с его геном-рецептором фолликулостимулирующего гормона (FSHR), а ФСГ оказывает положительное влияние на экспрессию hsa-miR-548ba.

МикроРНК hsa-miR-548ba, показывающая самые высокие уровни экспрессии в гранулезных клетках среди всех микроРНК семейства has-mir-548, не была обнаружена в фолликулярной жидкости. Мишенью микроРНК является путь переноса SLC2A4 (GLUT4) в плазматическую мембрану. GLUT4 участвует в поглощении глюкозы, а ФСГ стимулирует этот процесс в гранулезных клетках. Гранулезные клетки пациенток с синдромом поликистозных яичников имеют тенденцию проявлять аномальный метаболизм глюкозы. Следовательно, микроРНК hsa-miR-548ba может являться одним из регуляторов в патогенезе СПКЯ (Rooda I. et al., 2021).

Заключение

Ключевую роль в фолликулогенезе играет межклеточная коммуникация между ооцитом и окружающими его гранулезными и кумулюсными клетками. Обмен информацией между клетками внутри фолликула может обеспечиваться при помощи аутокринных и паракринных факторов, в том числе, везикулярных микроРНК и циркулирующих днРНК. Многие исследования показали, что микроРНК могут влиять на регуляцию секреции гормонов в гранулезных клетках человека (Tu J. et al., 2020; Xiao S. et al., 2024).  В клетках гранулезы вырабатывается эстроген, и эти клетки также участвуют в регуляции ФСГ, необходимого для развития фолликула (Рогова Л.Н. и др., 2023).

Нарушение апоптоза и других процессов в гранулезных клетках приводят к многочисленным изменениям в структуре и функции яичника, в том числе преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ), СПКЯ, эндометриозу, что, в конечном итоге, отражается на фертильности (Agarwal A. et al. 2012; Liu S. et al., 2023). 

Анализ цис-регуляторных районов генов, ответственных за молекулярный фенотип гранулезных клеток, может стать надежным инструментом для поиска регуляторных РНК, влияющих на эти гены. Изучение роли микроРНК и днРНК в гранулезных клетках не только даст новое понимание молекулярных механизмов физиологии яичников, но также может открыть новые терапевтические мишени для лечения гинекологических заболеваний, в частности, СПКЯ.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 23–15-00464.

Список литературы

1. Адамян Л.В. Клинические рекомендации «Синдром поликистозных яичников» / Адамян Л.В., Андреева Е.Н., Абсатарова Ю.С. //Проблемы эндокринологии. - 2022. – Т. 68, № 2. – С. 112-127.
2. Азизова Г.Д. Роль полиморфизма некоторых генов-кандидатов, участвующих в патогенезе синдрома поликистозных яичников / Азизова Г.Д. // Educational Research in Universal Sciences. - 2023. – Vol. 2. – P. 52–66.
3. Боярский К.Ю. Молекулярные процессы фолликулогенеза. От овуляции до формирования желтого тела (обзор литературы) / Боярский К.Ю., Кахиани Е.И. // Проблемы репродукции. – 2018. – Т. 24. – №. 2. – С. 9-22.
4. Зенкина В.Г. Молекулярные механизмы оогенеза / Зенкина В.Г. [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. – 2021. – Т. 20, №. 2. – С. 139-147.
5. Калугина А.С. Синдром поликистозных яичников: современные представления и роль в проблеме бесплодия (обзор литературы) / Калугина А.С., Бобров К.Ю. // Проблемы репродукции. – 2015. – Т. 21, № 2. – С. 31-35.
6. Марченко Л.А. Современные воззрения на ранние этапы фолликулогенеза и механизмы формирования преждевременной недостаточности яичников / Марченко Л.А., Машаева Р.И., Чернуха Г.Е. // Гинекология. - 2020. - №5. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/sovremennye-vozzreniya-na-rannie-etapy-follikulogeneza-i-mehanizmy-formirovaniya-prezhdevremennoy-nedostatochnosti-yaichnikov (дата обращения: 08.10.2024).
7. Петров И.А. Тканевые и молекулярные основы фолликулогенеза. Механизмы раннего фолликулярного роста / Петров И.А., Дмитриева М.Л., Тихоновская О.А. [и др.] // Проблемы репродукции. –  – Т. 23(5). – С. 33‑41.
8. Рогова Л.Н. Уровень апоптоза гранулезных клеток у женщин с нарушением репродуктивной функции и экстрагенитальной патологией / Рогова Л.Н., Липов Д.С., Перфилова В.Н. [и др.] // Вестник РГМУ. - 2023. - №3. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/uroven-apoptoza-granuleznyh-kletok-u-zhenschin-s-narusheniem-reproduktivnoy-funktsii-i-ekstragenitalnoy-patologiey (дата обращения: 08.10.2024).
9. Соколова Ю.В. Молекулярно-биологические основы внутрияичникового фолликулогенеза, созревания и рекрутинга фолликулов / Соколова Ю.В. [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2022. – Т. 1. – С. 22-30.
10. Agarwal A. The effects of oxidative stress on female reproduction: A review / Agarwal A., Aponte-Mellado A., Premkumar B.J. [et al.] // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2012. – Vol. 10. – P. 49. doi: 10.1186/1477-7827-10-49.
11. Ali R.M. Association of CYP17 gene polymorphism (rs743572) with polycystic ovary syndrome / Ali R.M., Shkurat T.P., Alexandrova A.A. [et al.] // Meta Gene. – 2023. – Vol. 31. – P. 100996.
12. Bulanov I. SNP Analysis Of LncRNA Genes Associated With Polycystic Ovary Syndrome Using GWAS Catalog And The 1000 Genomes Project / Bulanov I., Romanov D., Lipovich L. // In 2023 IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine (BIBM), 2023. - P. 2764-2766).
13. Liu S. Mechanisms of and Potential Medications for Oxidative Stress in Ovarian Granulosa Cells: A Review / Liu S., Jia Y., Meng S. [et al.] // Int J Mol Sci. – 2023. – Vol. 24;24(11). – P. 9205. doi: 10.3390/ijms24119205.
14. Mu L. Non-coding RNAs in polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis / Mu L., Sun X., Tu M., Zhang D. // Reproductive Biology and Endocrinology. – 2021. – Vol. 19. – P. 1-18.
15. Rooda I. Hsa-mir-548 family expression in human reproductive tissues/ Rooda I. [et al.] // BMC Genomic Data. – 2021. – Vol. 22. – С. 1-13.
16. Tu J. Long non-coding RNAs in ovarian granulosa cells / Tu J., Chen Y., Li Z. [et al.] // J Ovarian Res. – 2020. – Vol. 5;13(1). – P. 63. doi: 10.1186/s13048-020-00663-2.
17. Tu M. Effect of lncRNA MALAT1 on the granulosa cell proliferation and pregnancy outcome in patients with PCOS / Tu M., Wu Y., Wang F. [et al.] // Frontiers in Endocrinology. – 2022. – Vol. 13. – P. 825431.
18. Welt C.K. Genetics of PCOS: What’s New? / Welt C.K. // Endocrinology and metabolism clinics of North America. - 2021. – Vol. 50. – P. 71. doi:10.1016/J.ECL.2020.10.006

19. Xiao S. Granulosa Cells-Related MicroRNAs in Ovarian Diseases: Mechanism, Facts and Perspectives / Xiao S., Du J., Yuan G. [et al.] // Reprod. Sci. - doi:10.1007/s43032-024-01523-w
20. Zhao J. Polycystic ovary syndrome: novel and hub lncRNAs in the insulin resistance-associated lncRNA–mRNA network / Zhao J., Huang J., Geng X. [et al.] // Frontiers in genetics. – 2019. – Vol. 10. – P. 772.

Статья поступила в редакцию 6 сентября 2024 г.

Принята к печати 20 сентября 2024 г.

Received 6, September, 2024

Accepted 20, September, 2024