К вопросу о сохранности древней ДНК из костных останков позднесарматских погребений могильных групп Аршань-Зельмень для STR анализа

Введение

На базе Калмыцкого научного центра РАН в рамках мегагранта «От палеогенетики до культурной антропологии: комплексное интердисциплинарное исследование традиций народов трансграничных регионов: миграции, межкультурное взаимодействие и картина мира» созданы: - блок «Костехранилище» в котором хранится палеонтропологический материал из археологических памятников, различной культурной принадлежности, расположенных на территории Республики Калмыкия; - блок «Генетических исследований» в котором проводятся работы с древней ДНК (дДНК), включая пробоподготовку образцов, выделение ДНК, ее амплификация и электрофорез.

В настоящее время исследования посвященные изучению генетической информации из палеонтропологического материала актуальное направление, разрабатываемое ведущими лабораториями, как России, так и мира (Андреева и др., 2022; Молодин и др., 2023; Barouch et al., 2024; Eppie et al., 2015). Активно разрабатывается направление изучения костных останков из курганных погребений Юга России по материалам исследования STR-локусов (Балабанова, 2019; Вдовченков и др., 2023; Корниенко, 2021; Пилипенко и др., 2020).

На территории Республики Калмыкия сосредоточено большое количество древних курганов, археологических памятников эпохи бронзы — раннего железного века — средневековья (Очир-Горяева, 2008). Именно образцы раннего железного века (поздние сарматы) и стали объектом данного исследования.

В 1993 г. археологической экспедицией Калмыцкого научно-исследовательского института истории, филологии, экономики (КНИИ ИФЭ) были проведены спасательные раскопки курганов на территории Сарпинского района в зоне строительства автодороги. Курганная группа была расположена к юго-востоку от районного центра Садовое, на отрогах хамура перед фермой совхоза Аршань-Зельмень. Курганы этого могильника были раскопаны по Открытому листу С. В. Арапова и были названы могильником Аршань-Зельмень II, могильник Аршань-Зельмень III; могильник Аршань-Зельмень IV. Отчет по раскопкам могильника Аршань-Зельмень не был написан. Материалы для его написания были подготовлены, но затем, по всей видимости, утеряны автором раскопок (Очир-Горяева, 2009).

Цель работы заключается в оценке качества выделенной дДНК из костных останков позднесарматских погребений, расположенных на территории Республики Калмыкия для проведения STR анализа.

Материал и методы исследования

В качестве материала исследования выбран палеоантропологический материал 3-х могильных групп позднесарматского погребения «Аршань-Зельмень»: могильник Аршань-Зельмень II; могильник Аршань-Зельмень III; могильник Аршань-Зельмень IV. В качестве источника генетической информации были использованы зубы (моляры с корнями) хорошего или приемлемого качества. Сохранность зубов образца AЗ II K3П2 очень плохая, антропологи связывают это с тем, что это костяк ребенка.

Все молекулярно-генетические исследования выполнены в блоке генетических исследований Калмыцкого научного центра РАН (г. Элиста). Лаборатория соответствует требованиям для работы с дДНК, все сотрудники контактирующие с костными образцами, а также сотрудники лаборатории генотипированы и внесены в базу данных для исключения загрязнения образцов современной ДНК. Обработка помещений и инструментов, наведение растворов, уборка — проводились в соответствии с рекомендациями указанными в работах (Корниенко, Харламов, 2012; Арамова, 2023).

Процедуры предварительной обработки палеоантропологического материала, его деконтаминации, получения костного порошка проводили в соответствии с протоколами.

Протокол предварительной обработки костного материала:

1) с помощью шлифмашины Dremel 4000 очищали поверхность зуба, от всех загрязнений, снимая эмаль;

2) очищенный костный материал подвергали ультрафиолету, в системе УФ-дозированного облучения BLX multichannel Bio-Link crosslinker, Vilber, в течение 15 минут с каждой стороны зуба;

3) обработанный зуб помещали в размольные стаканы на 10 мл, предварительно выдержанные при - 20°С в морозильной камере, для гомогенизации образца использовали вибрационную мельницу ММ400, Retsch;

4) полученный костный порошок взвешивали в количестве 50 мг и переносили в пробирки с закручивающейся крышкой объемом 2 мл.

Выделение ДНК из каждого костного порошка осуществлялось в четырех повторностях, для получения обобщенного генотипа, по методике предложенной в работе (Корниенко и др., 2021).

Выделение ДНК из зубов проводили с использованием ВТА буфера Prepfiler, руководствуясь инструкцией производителя.

Для мониторинга возможной контаминации при экстрагировании ДНК использовался отрицательный экстракционный контроль (К.в.) – образец, не содержащий биоматериал.

Полученные образцы использовали в качестве матричных препаратов ДНК для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Анализ матричной активности препаратов ДНК, содержащих генетический материал, проводили с помощью флуориметрического метода с использованием системы количественной оценки ДНК «1X dsDNA High Sensitivity (HS)» (Invitrogen, США), руководствуясь инструкцией фирмы-изготовителя. Количество выделенной ДНК регистрировали с использованием флуориметра Qubit 4 (Invitrogen, США).

Типирование полиморфных STR-локусов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием энзиматической амплификации

24-локусной панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США):

D3S1358, vWA, D16S539, CSF1PO, TPOX, Yindel, Amel, D8S1179, D21S11, D18S51, DYS391, D2S441, D19S433, THO1, FGA, D22S1045, D5S818, D13S317, D7S820, SE33, D10S1248, D1S1656, D12S391, D2S1338

25 указанных локусов системы AmpFlSTR^® Yfiler^™ Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США):

DYS576, DYS389I, DYS635, DYS389II, DYS627, DYS460, DYS458, DYS19, YGATAH4, DYS448, DYS391, DYS456, DYS390, DYS438, DYS392, DYS518, DYS570, DYS437, DYS385, DYS449, DYS393, DYS439, DYS481, DYF387S1, DYS533

- руководствуясь инструкциями фирмы-изготовителя.

Для оценки специфичности реакции амплификации использовали препараты контрольной ДНК DNA 9947А (положительный контроль, К+) с известными генотипическими признаками (D3S1358 – 15,16, vWA – 14,16, D16S539 – 9,10, CSF1PO – 11,12, TPOX – 8,8, Yindel – 2, Amel – XY, D8S1179 – 12,13, D21S11 – 28,31, D18S51 – 12,15, DYS391 – 11, D2S441 –14,15, D19S433 –14,15, THO1 –7,9.3, FGA –24,26, D22S1045 –11,16, D5S818 – 11,11, D13S317 – 11,11, D7S820 – 7,12, SE33 –17,25.2, D10S1248 –12,15, D1S1656 –13,16, D12S391 – 18,19, D2S1338 –20,23), для панели AmpFlSTR^® Yfiler^™ Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) DNA Control 007 (DYS576 – 19, DYS389I – 13, DYS635 – 24, DYS389II – 29, DYS627 – 21, DYS460 – 11, DYS458 – 17, DYS19 – 15, YGATAH4 – 13, DYS448 – 19, DYS391 – 11, DYS456 – 15, DYS390 – 24, DYS438 – 12, DYS392 – 13, DYS518 – 37, DYS570 – 17, DYS437 – 15, DYS385 – 11,14, DYS449 – 30, DYS393 – 13, DYS439 – 12, DYS481 – 22, DYF387S1 – 35,37, DYS533 –13) и препарат, не содержащий ДНК (отрицательный контроль, К-).

Продукты полимеразной цепной реакции фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).

Полученные электрофореграммы анализировали с использованием штатного программного обеспечения GeneMapper ID-X^® 1.5 (Applied Biosystems, США) и устанавливали индивидуальные генотипические комбинации аллельных вариантов (профили ПДАФ) типируемых STR-локусов.

Результаты и обсуждение

Данные эффективной концентрации ДНК в исследуемых объектах представлены в таблице 1. В таблице представлены усредненные данные, полученные по всем повторностям генетического анализа.

Таблица 1 – Количественные характеристики выделенной древней ДНК

*концентрация компонента в стандарте 1 — 0 ng/μL, в стандарте 2 — 10 ng/μL

Исходя из данных таблицы концентрация выделенной дДНК варьирует от 0,19 до 0,86 нг/мкл, что соответствует требованиям использованной системы AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit и AmpFlSTR^® Yfiler Plus^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США (не ниже 0,01 нг/мкл). В образце AЗ II K3П2 выделенная дДНК флуориметрическим методом не детектируется, однако выделенный образец также использован для дальнейшего исследования.

В таблице 2 представлены результаты генотипирования по системе Globalfiler четырех последовательностей из образца AЗ II K2П1 и обобщенный (консенсусный) генотип. Полученные профили четырех повторностей ПДАФ AЗ II K2П1 также представлены в приложении (Приложение 1–4).

Таблица 2 – Результаты генотипирования образца AЗ II K2П1 по 24-локусной системе Globalfiler и получение обобщенного генотипа

В результате исследования установлено, что, несмотря на относительно хорошие концентрации ДНК при выделении, в полученном генетическом профиле наблюдается деградация, выраженная выпадением аллелей и локусов, что характерно для древней ДНК.

Деградация ДНК отмечена и в остальных исследуемых образцах, однако нам удалось получить относительно хорошие генетические профили для образцов AЗ II K1П1, АЗ III К1П1, АЗ III К2П1, АЗ II K3П1, (приложение 5–8 соответственно). В результате исследования препаратов могильников Аршань-Зельмень, установлено, что исследуемая выборка состояла из 3 мужчин и 3 женщин, образец АЗ II K3П2 (по антропологическим данным — ребенок) генотипировать не удалось, из-за сильной деградации ДНК.

Результаты типирования STR-локусов исследуемых образцов представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Обобщенные результаты генотипирования костных образцов могильников Aршань-Зельмень по 24-локусной системе Globalfiler

Полученные результаты позволяют говорить об относительно хорошей сохранности дДНК в костных образцах (зубы) позднесарматских погребений, расположенных на территории Республики Калмыкия. А результаты генотипирования могут быть использованы для установления кровно-родственных связей и установления половой принадлежности образцов. В результате анализа локуса Amelogenin, определяющего половую принадлежность, установлено, что образцы AЗ II K1П1, АЗ III К1П1 и АЗ IV К1П1 имеют мужскую половую хромосому.

Перечисленные выше образцы подверглись генотипированию Y-хромосомы по системе Yfiler Plus, результаты типирования представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Обобщенные результаты генотипирования костных образцов могильников Aршань-Зельмень по 25-локусной системе Yfiler Plus

Исходя из данных таблицы 4 видно, что получены удовлетворительные генетические профили, которые позволили определить вероятную принадлежность исследованных препаратов дДНК к той или иной гаплогруппе.

В образце AЗ II K1П1 установлена Y-гаплогруппа — E1b1b M123>M34> M84 (Рис. 1).

Рис. 1. – Установленная гаплогруппа по онлайн предиктору (YHRD Y Haplogroup Prediction / NEVGEN Y Haplogroup)

Данная гаплогруппа характерна для населения Ливана (древних левантинцев). Она достигает пика в южном Леванте (10–12% в Палестине и Ливане), откуда распространяется на Ближнем Востоке, в Северной Африке, Южной Азии и Юго-Восточной Европе. Левантинский род E1b1b1c (M123) имеет одну ветвь — E1b1b1c1 (M34), которая представляет потомков ханаанеев, хеттов и хурритов (Романчук, 2015).

В образце АЗ III К1П1 установлена Y-гаплогруппа — N1a2 CTS6380 (Рис. 2).

Рис. 2. – Установленная гаплогруппа по онлайн предиктору (YHRD Y Haplogroup Prediction / NEVGEN Y Haplogroup)

Гаплогруппа N1a2 (CTS6380»L67) распространена на Алтае, в Азербайджане и Турции. Среди образцов из археологических раскопок эта же гаплогруппа выявлена у двух индивидуумов из позднесредневековых могильников центральных районов Якутии. Предполагается, что гаплогруппа N1a2 (CTS6380»L67) возникла в Южной Сибири и оттуда распространилась на территорию Турции, Азербайджана и Якутии вместе с группами тюрков (Романчук, 2015).

В образце АЗ IV К1П1 установлена Y-гаплогруппа — R1a M198 (Рис. 3).

Рис. 3. – Установленная гаплогруппа по онлайн предиктору (YHRD Y Haplogroup Prediction / NEVGEN Y Haplogroup)

R1a-M198 — гаплогруппа Y-хромосомы, распространение: В Азии R1a-M198 занимает более половины генофонда киргизов и таджиков, умеренно встречается у узбеков (21–29%) и у степной аристократии, процент понижается у казахов и туркменов. В Индии установлена высокая частота этой гаплогруппы в кастовых группах, есть мнение, что это следствие миграции арийских племён. В соседнем для Индии Пакистане носители R1a совокупно составляют 37% населения. В Европе R1a-M198 имеет менее четырёх процентов (в Испании, Португалии, в Уэльсе, Ирландии, во Франции и Южной Италии, на Мальте, Кипре и в Швейцарии). У южных славян носителей насчитывается от 7% в Черногории, до 22% в Хорватии (Романчук, 2015).

Заключение

Палеоантропологический материал позднесарматских погребений из могильных групп, расположенных на территории Республики Калмыкия характеризуется относительно хорошей сохранностью генетического материала, что позволяет генотипировать образцы по STR-локусам, для установления кровно-родственных связей, половой структуры и принадлежности к гаплогруппам.

Благодарности

Статья написана в рамках государственной субсидии - проект «Юго-восточный пояс России: исследование политической и культурной истории социальных общностей и групп» (номер госрегистрации: 122022700134-6). Лабораторное оборудование и реагенты приобретены в рамках субсидии из федерального бюджета, выделяемой для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущего ученого (проект «От палеогенетики до культурной антропологии: комплексное интердисциплинарное исследование традиций народов трансграничных регионов: миграции, межкультурное взаимодействие и картина мира»). 

Список литературы

1. Андреева Т. В., Малярчук А. Б., Сошкина А. Д., Дудко Н. А., Плотникова М. Ю., Рогаев Е. И. Методологии выделения древней ДНК из костной ткани для геномного анализа: подходы и практические рекомендации // Генетика. 2022. № 9. С. 979–998.
2. Арамова О. Ю. История палеогенетических исследований: от распределения по группам крови до генетических открытий (обзор) // Живые и биокосные системы, 2023 № 45.
3. Археологические памятники волго-манычских степей: (свод памятников, исследованных на территории Республики Калмыкия в 1929-1997 гг.) / М. А. Очир-Горяева; Российская акад. наук, Калмыцкий ин-т гуманитарных исслед. Элиста: Изд. дом «Герел», 2008. 298 с.
4. Балабанова М. А. Этногенетические связи населения среднесарматского времени восточноевропейских степей // Вестник Волгоградского государственного университета. 2019. T. 24. № 5. С. 51–66.
5. Вдовченков Е. В., Арамова О. Ю., Джи Ын Ли, Леонова Д. К., Флоринская В. С., Тищенко А. А., Корниенко ИВ Происхождение донских меотов и сарматов по данным палеогенетики (по результатам аутосомных STR-локусов) // Материалы по археологии и истории античного и средневекового Причерноморья. 2023. № 15. С. 443–456.
6. Корниенко И. В., Фалеева Т. Г., Шурр Т. Г., Арамова О. Ю. Y-гаплогруппы костных останков из курганных погребений хазарского времени на территории юга России // Генетика. 2021. T. 57. № 4. С. 464–477.
7. Корниенко И. В., Харламов С. Г. Методы исследования ДНК человека. Ростов н/Д.: ЮФУ, 2012. 216 с.
8. Молодин В. И., Пилипенко А. С., Поздняков Д. В. Современное состояние этногенетических реконструкций популяций эпохи бронзы юго-западной Сибири (некоторые итоги и перспективы) // Российская археология. 2023. № 1. С. 41–52.
9. Очир-Горяева М. А. Богатое позднесарматское погребение из могильника Аршань-Зелмень // Нижневолжский археологический вестник. 2009. Вып. 10. С. 363-371.
10. Пилипенко А. С., Черданцев С. В., Трапезов Р. О., Томилин М. А., Балабанова М. А., Пристяжнюк М. С., Журавлев А. А. К вопросу о генетическом составе сарматского населения Нижнего Поволжья (Данные палеогенетики) // Вестник Волгоградского государственного университета, 2020. № 4.
11. Романчук А. А. Восточноевразийская гипотеза дене-кавказской прародины: еще раз к вопросу о гаплогруппах Y-хромосомы. Кишинев: Периодическое издание «Stratum plus», 2015. 198 с.
12. Barouch A., Mathov Y., Meshorer E., Yakir B., Carmel L. Reconstructing DNA methylation maps of ancient populations // Nucleic Acids Research. 2024. Vol. 52. no. 4. pp. 1602–1612.
13. Jones E. R, Gonzalez-Fortes G, Connell S, Siska V, Eriksson A, Martiniano R, McLaughlin R. L, Gallego Llorente M, Cassidy L. M, Gamba C, Meshveliani T, Bar-Yosef O, Müller W, Belfer-Cohen A, Matskevich Z, Jakeli N, Higham TF .G, Currat M, Lordkipanidze D, Hofreiter M, Manica A, Pinhasi R, Bradley D. G. Upper Palaeolithic genomes reveal deep roots of modern Eurasians // Nature Communications. 2015. Vol. 6. P. 8912.

References

1. Andreeva T. V., Malarchuk A. B., Soshkina A. D., Dudko N. A., Plotnikova M. Yu., Rogaev E. I. Methodologies for isolating ancient DNA from bone tissue for genomic analysis: approaches and practical recommendations // Genetics. 2022. No. 9. P. 979–998.
2. Aramova O. Yu. History of paleogenetic research: from distribution by blood groups to genetic discoveries (review) // Living and bio-osteal systems, 2023, No. 45.
3. Archaeological sites of the Volga-Manych steppes: (a collection of sites explored on the territory of the Republic of Kalmykia in 1929–1997) / M. A. Ochir-Goryaeva; Russian Academy of Sciences, Kalmyk Institute of Humanitarian Research. Elista: Gerel Publishing House, 2008. 298 p.
4. Balabanova M. A. Ethnogenetic connections of the population of the Middle Sarmatian period of the Eastern European steppes // Bulletin of Volgograd State University. 2019. Vol. 24. No. 5. P. 51–66.
5. Vdovchenkov E. V., Aramova O. Yu., Ji Eun Lee, Leonova D. K., Florinskaya V. S., Tishchenko A. A., Kornienko I. V. The origin of the Don Meotians and Sarmatians according to paleogenetic data (based on the results of autosomal STR loci) // Materials on the archeology and history of the ancient and medieval Black Sea region. 2023. No. 15. P. 443–456.
6. Kornienko I. V., Faleeva T. G., Shurr T. G., Aramova O. Yu. Y-haplogroups of bone remains from burial mounds of the Khazar period in the south of Russia // Genetics. 2021. Vol. 57. No. 4. Pp. 464–477.
7. Kornienko I. V., Kharlamov S. G. Methods of human DNA research. Rostov n / D.: SFedU, 2012. 216 p.
8. Molodin V. I., Pilipenko A. S., Pozdnyakov D. V. Current state of ethnogenetic reconstructions of Bronze Age populations in southwestern Siberia (some results and prospects) // Russian archeology. 2023. No. 1. Pp. 41–52.
9. Ochir-Goryaeva M. A. Rich late Sarmatian burial from the Arshan-Zelmen cemetery // Lower Volga Archaeological Bulletin. 2009. Issue 10. Pp. 363-371.
10. Pilipenko A. S., Cherdantsev S. V., Trapezov R. O., Tomilin M. A., Balabanova M. A., Pristyazhnyuk M. S., Zhuravlev A. A. On the issue of the genetic composition of the Sarmatian population of the Lower Volga region (Paleogenetic data) // Bulletin of Volgograd State University, 2020. No. 4.
11. Romanchuk A. A. East Eurasian hypothesis of the Dene-Caucasian ancestral homeland: once again on the issue of Y-chromosome haplogroups. Chisinau: Periodical publication “Stratum plus”, 2015. 198 p.
12. Barouch A., Mathov Y., Meshorer E., Yakir B., Carmel L. Reconstructing DNA methylation maps of ancient populations // Nucleic Acids Research. 2024. Vol. 52. no. 4. pp. 1602–1612.
13. Jones E. R, Gonzalez-Fortes G, Connell S, Siska V, Eriksson A, Martiniano R, McLaughlin R. L, Gallego Llorente M, Cassidy L. M, Gamba C, Meshveliani T, Bar-Yosef O, Müller W, Belfer-Cohen A, Matskevich Z, Jakeli N, Higham TF .G, Currat M, Lordkipanidze D, Hofreiter M, Manica A, Pinhasi R, Bradley D. G. Upper Palaeolithic genomes reveal deep roots of modern Eurasians // Nature Communications. 2015. Vol. 6. P. 8912.

Статья поступила в редакцию 20 августа 2024 г.
Поступила после доработки 26 августа 2024 г.
Принята к печати 4 сентября 2024 г.
Received 20, August, 2024
Revised 26, August, 2024
Accepted 4, September, 2024

Приложение 1 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ II K2П1 а).

Приложение 2 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ II K2П1 б).

Приложение 3 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ II K2П1 в).

Приложение 4 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ II K2П1 г).

Приложение 5 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ II K1П1).

Приложение 6 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ III K1П1).

Приложение 7 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ III K2П1).

Приложение 8 – Электрофореграмма аутосомных STR-локусов панели AmpFlSTR^® Globalfiler^™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США) (объект AЗ II K3П1).