Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на способность патогенных коринебактерий к образованию биопленок

Введение

В условиях проведения вакцинопрофилактики эпидемический процесс дифтерийной инфекции реализуется преимущественно в виде бактерионосительства. Интенсивность циркуляции патогенных коринебактерий напрямую связана с периодическим формированием эпидемически значимых (более вирулентных и приспособленных к колонизации) популяций возбудителя.

Электромагнитное поле (ЭМП), как возможный индуктор изменчивости микроорганизмов, обратило на себя внимание в связи с исследованиями роли метеорологических условий в возникновении и развитии инфекционных заболеваний. Обсуждение вопросов физических механизмов действия слабых ЭМП на биообъекты особенно активно проводится в последнее время [1-6]. Ключевая идея о чувствительности биологических объектов к слабым ЭМП основывается на предположении, что миллиметровые волны оказываются естественными для биообъектов и могут использоваться клетками в направлении «управления» основными физиологическими функциями.

Терапевтический эффект излучения миллиметрового диапазона, крайне высокой частоты и низкой интенсивности (КВЧ-излучения) на сегодняшний день доказан при многих заболеваниях человека. Эффективность использования электромагнитных полей низкой интенсивности (КВЧ-излучение) в биотехнологических процессах также доказана рядом исследований. Получаемые при облучении микроорганизмов эффекты в дальнейшем могут явиться основой новых методов получения вакцин, увеличения продуктивности при получении антибиотиков. Однако, публикации, посвященные исследованию воздействия КВЧ-излучения на различные микроорганизмы, немногочисленны.

На современном этапе развития науки многие ученые поддерживают идею о том, что основной формой существования микроорганизмов является биопленка, когда микроорганизмы прикрепляются к поверхности, с последующим образованием биополимерного матрикса и развитием межклеточных коммуникаций [7-9]. В биопленках обмен информацией происходит с помощью специализированных сигнальных молекул, благодаря чему микробное сообщество работает как единый организм [7, 9]. При этом микроорганизмы, входящие в состав биопленок, как правило, резистентны к противомикробным средствам, обладают способностью противодействовать факторам иммунной защиты и характеризуются способностью к обмену информацией между клетками и коллективной координацией экспрессии генов [7]. Описанные данные во многом объясняют патогенез формирования бактерионосительства и хронических форм инфекционных процессов [7-9]. Поэтому, в последние годы, особое внимание уделяется, как способности микроорганизмов образовывать биопленки, так и факторам, влияющим на указанный процесс.

В свете вышеизложенного огромное значение приобретает исследование влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на способность возбудителей дифтерии к образованию биопленок.

Цель исследований

Изучить способность патогенных коринебактерий к образованию биопленок под влиянием электромагнитного излучения частотных диапазонов 42,2 ГГц и 61,0 ГГц.

Материал и методы исследования

В качестве тест-культур использовали штаммы патогенных коринебактерий  Corynebacterium diphtheriae (n=8). Суспензии тест-культур микроорганизмов готовили в соответствии со стандартом мутности по шкале McFarland с помощью прибора Densi-La-Meter (Lachema, Чехия) и доводили до оптической плотности 1,0 единица по шкале McFarland согласно инструкции к прибору. Синхронизацию культур проводили с помощью действия низкой температуры.

Для облучения суспензий микроорганизмов электромагнитным полем в узких полосах частот (квазигармонический сигнал) КВЧ-диапазона использовались генераторы сигналов Г4-141 (f₁ = 37,5-53,57) ГГц и Г4-142 (f₂ = 53,57-78,33) ГГц. Пробирки с культурами при комнатной температуре, без перемешивания, располагали вблизи от отверстия  прямоугольного рупора с сечением 6,0-5,0 см (для генератора Г4-141) и 8,5-6,5 см (для генератора Г4-142). Во время облучения электромагнитным полем объекты находились на расстоянии L » 5-7 см от плоскости апертуры, то есть в ближней зоне антенны. В месте их расположения плотность потока мощности (ППМ) достигала величин ~ 0,1 мВт/см² при неравномерности облучения в месте расположения объектов в пределах 3 дБ, что связано со спецификой ближней зоны, конечными размерами апертуры и облучаемых объектов, а также низким импедансом нагрузки. Тест-культуры патогенных коринебактерий обрабатывали электромагнитным полем в частотных диапазонах 42,2 ГГц и 61,0 ГГц, при этом экспозиция воздействия составляла 3 часа.

Определение способности микроорганизмов к образованию биопленок. проводили с использованием полистирольных микротитровальних планшет по методике, описанной Stepanovic и др. в авторской модификации [10].

Штаммы патогенных коринебактерий выращивали в течение 18-24 часов на питательном агаре, содержащем 20% лошадиной сыворотки. Затем готовили взвесь культур микроорганизмов в стерильном физиологическом растворе с оптической плотностью 1,0 единица по шкале MacFarland. Приготовленные образцы бактериальных суспензий разводили (1:10) в стерильном 1% сахарном бульоне, (конечная микробная нагрузка составляла 3×10⁷ КОЕ/мл) и добавляли по 200 мкл каждого образца в лунки полистироловых планшетов в трех повторах. В качестве негативного контроля в три лунки полистироловых планшетов добавляли только 200 мкл стерильного питательного бульона, содержащего 1% глюкозы.

Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 часов, затем содержимое лунок отсасывали, каждую лунку промывали трижды стерильным физиологическим раствором. Планшеты интенсивно встряхивали, чтобы удалить все неадгезированные бактерии. После просушивания на воздухе, для окраски сформировавшихся биопленок в лунки планшета добавляли по 200 мкл 0,1% кристаллического фиолетового и оставляли на 15 мин. Затем каждую лунку промывали три раза стерильной дистиллированной водой и  высушивали при комнатной температуре. Краситель, связанный с адгезированными клетками, экстрагировали в течение 30 мин, добавляя по 200 мкл 96% этанола в лунки планшет.

Оптическую плотность биопленок измеряли на спектрофотометре (Stat Fax) при длине волны 492 нм. Исходя из оптической плотности образцов (ОПо) и средней оптической плотности отрицательного контроля (ОПк), по способности к биопленкообразованию штаммы были разделены на группы: с сильной (4×ОПк<ОПо), умеренной (2×ОПк<ОПо≤4×ОПк) , слабой (ОПк<ОПо≤2×ОПк) способностью к образованию биопленок или такие, которые не способны к биопленкообразованию (ОПо≤ОПк).

Каждый эксперимент проводили минимум в трех повторах. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета анализа данных Stаtistica-8. Для оценки достоверности различий в показателей использовали непараметрические критерии: критерий Вилкоксона и  критерий знаков.  Достоверность различий относительных величин оценивали с помощью критерия χ-квадрат.

Результаты исследования и их обсуждение

На сегодняшний день способность возбудителей дифтерии к образованию биопленок практически не изучена, несмотря на тот факт, что указанная способность является определяющим фактором для реализации первого этапа инфекционного процесса  (прикрепления возбудителя в месте внедрения в макроорганизм) а также дальнейшего развития инфекционного процесса. 

При исследовании способности тест-культур патогенных коринебактерий к образованию биопленок до воздействия физических факторов установлено, что у 12,5 % исследованных штаммов образование стойких биопленок на полистирольных планшетах не наблюдалось, слабой способностью к биопленкообразованию обладали 12,5 % тест-культур и по 37,5 % штаммов характеризовались средним и высоким уровнем биопленкообразования (рис. 1).

Обработка тест-культур патогенных коринебактерий электромагнитными полями миллиметрового диапазона приводила к изменениям их способности к биопленкообразованию. Следует отметить, что направленность изменений зависела от частотного диапазона физического фактора, применявшегося для облучения. 

Установлено, что КВЧ-волны в частотном диапазоне 61,0 ГГц оказывали стимулирующее воздействие на биопленкообразующие способности коринебактерий. При этом, как видно из рис. 1, доля штаммов, обладающих высокой способностью к формированию биопленок, возросла в 2 раза по сравнению с контролем (р<0,05). Средние показатели оптической плотности сформированных биопленок достоверно превышали контрольные в 1,6 раз (табл. 1).

  Рис. 1 – Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на способность патогенных коринебактерий к образованию биопленок

Таблица 1 – Оптическая плотность биопленок тест-культур коринебактерий при облучении электромагнитными волнами КВЧ-диапазона

* - разница достоверна по сравнению с контролем (р<0,05).

Обратный эффект отмечен после воздействия на коринебактерии ЭМП частотного диапазона 42,2 ГГц. Указанный режим обработки приводил к тому, что доля штаммов с высокой способностью образовывать биопленки снизилась с 37,5 % до 12,5 % (р<0,05), а с низкой, наоборот – увеличилась (рис. 1). При сравнении показателей оптической плотности биопленок коринебактерий, сформировавшихся после обработки ЭМП в вышеуказанном частотном диапазоне, и контрольных образцов выявлена лишь тенденция к снижению данного показателя (табл. 1).

Рассматривая механизмы влияния ЭМП на субклеточном уровне, необходимо отметить работы, в которых показано, что энергия электромагнитных облучений может быть использована для активного транспорта ионов через мембрану. Это происходит когда циклический перенос зарядов в трансмембранном ферменте совпадает по фазе с внешним осциллирующим полем. В этом случае наблюдается поглощение энергии электромагнитного поля ферментом и превращение ее в химическую энергию благодаря переносу ионов против градиента концентрации и синтеза АТФ. Все это приводит к изменению ферментативной активности клетки.

Шахбазовым В.Г. (1991 г.) была выдвинута гипотеза о функционировании ядерного генома, согласно которой ядро клетки является генератором високоупорядоченных акустических и электромагнитных излучений в клетке и за ее пределами. Энергией, питающей биосциляторы ядра, является тепловая энергия. Облучения ядерного генератора обусловливают формирование ядерного биоэлектрического потенциала, участвуют в регуляции ядерно-плазменного обмена и динамических процессах клетки. В связи с вопросами биологических эффектов микроволновых излучений это предположение дает широкое поле для эксперимента и анализа. Внешнее микроволновое излучение должно вступать в сложные взаимоотношения с ядерным генератором клетки или его аналогом, благодаря чему так много неоднозначных и сложных интерпретаций биологических эффектов воздействия ЭМП. Зачастую эмпирически подобранные режимы облучения дают положительные эффекты.

Среди систем регуляции, основанных на конформационных изменениях, а, следовательно, и изменениях концентрации реагентов, можно выделить две, которые имеют различные структурные элементы, но одинаковый принцип - метаболическую и гормональную. Метаболическая система регуляции основана на изменении функциональной активности ферментов. Энергия активации окислительно-восстановительных ферментативных реакций с участием ферментов в переносе электронов (биологически важный сигнал) связывается с субъединицей своего специфического белка-рецептора, в результате чего возрастает активность последнего. Это обеспечивает рецептору возможность взаимодействия с белком, который активирует ферменты-эффекторы; а они, в свою очередь, индуцируют появление большего количества внутриклеточных мессенджеров, в результате чего происходит многократное усиление сигнала. Существует предположение, что влияние микроволн служит пусковым фактором смещения концентрации одного из соединений (регуляторов) до уровня, определяющего активизацию того или иного энзима [1, 3-6].

Выводы

Способность к образованию биопленок выявлена у 87,5 % тест-культур коринебактерий. При этом по 37,5 % штаммов обладали  средним и высоким уровнем биопленкообразования. 

Миллиметровые волны в частотном дипазоне 61,0 ГГц оказывали стимулирующее влияние на способность патогенных коринебактерий к образованию биопленок.

При исследовании воздействия ЭМП частотного диапазона 42,2 ГГц на биопленкообразование тест-культур коринебактерий отмечено угнетение изучаемого признака.

Поскольку основным механизмом, обеспечивающим персистенцию бактерий, в том числе и возбудителей инфекционных заболеваний, является способность микроорганизмов к адгезии и образованию биопленок, исследования, связанные с поиском методов влияния на указанные свойства, являются перспективными. В связи с этим фактом, влияние электромагнитных полей миллиметрового диапазона на микроорганизмы требует более глубокого и всестороннего изучения.

Список литературы

1. Девятков, Н. Д., Голант М. Б., Бецкий О.В. Особенности медико – биологического применения миллиметровых волн // М.,: Изд – во ИРЭ РАН, 1994. – 164 с.
2. Кряжев Д. В., Смирнов В.Ф. Новые аспекты применения низкоинтенсивных излучений (КВЧ) в экобиотехнологии // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2010. – № 2. – с. 418-422.
3.  Кудряшов, Ю. Б., Исмаилов Э. Ш., Зубкова С. М. Биологические основы действия микроволн (учебное пособие) // М. : Изд-во Моск. Ун-та, 2002. – 159 с.
4.  Ситько, С. П., Мкртчян Л. Н. Введение в квантовую медицину //К.: Пантеон, 2004. – 147 с.
5. Adey W. R. Tissue interaction with no ionizing electromagnetic fields // Physiol. Rev. – 2001. – Vol.61, № 2. – P. 435-514.
6. Blinowska, K. J., Lech W., Wittlin A. Membranes as a Possible Site of Frolics Coherent Oscillations // Phys. Letters. – 2005. – Vol. 109A, №3. - P. 124-126.
7. Cortes, M. E., Bonilla J. C., Sinisterra R. D. Biofilm formation, control and novel strategies for eradication  // J. FORMATEX. – 2011. – Р. 896-905.
8. Mah, Thien-Fah C., O’Toole George A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents // J. Microbiology. – 2001. - V. 9, № 1 January. Р. – 34- 39.
9. Myszka K., Czaczyk К. Mechanisms Determining Bacterial Biofilm Resistance to Antimicrobial Factors // Antimicrobial Agents. - Р. 213-238.
10. Rodrigues L. B., Santos L. R., Tagliari V. Z., Rizzo N. N. et al. Quantification of biofilm production on polystyrene by Listeria, Escherichia coli and Staphylococcus aureus isolated from a poultry slaughterhouse  // Brazilian Journal of Microbiology. – 2010. - V. 41. – P. 1082-1085.
    

Spisok literatury 

1. Devyatkov, N. D., Golant M. B., Beckij O.V. Osobennosti mediko – biologicheskogo primeneniya millimetrovyx voln // M.,: Izd – vo IRE' RAN, 1994. – 164 s.
2. Kryazhev D. V., Smirnov V.F. Novye aspekty primeneniya nizkointensivnyx izluchenij (KVCh) v e'kobiotexnologii // Vestnik Nizhegorodskogo universiteta im. N.I. Lobachevskogo, 2010. – № 2. – s. 418-422.
3. Kudryashov, Yu. B., Ismailov E'. Sh., Zubkova S. M. Biologicheskie osnovy dejstviya mikrovoln (uchebnoe posobie) // M. : Izd-vo Mosk. Un-ta, 2002. – 159 s.
4. Sit'ko, S. P., Mkrtchyan L. N. Vvedenie v kvantovuyu medicinu //K.: Panteon, 2004. – 147 s.
5. Adey W. R. Tissue interaction with no ionizing electromagnetic fields // Physiol. Rev. – 2001. – Vol.61, № 2. – P. 435-514.
6. Blinowska, K. J., Lech W., Wittlin A. Membranes as a Possible Site of Frolics Coherent Oscillations // Phys. Letters. – 2005. – Vol. 109A, №3. - P. 124-126.
7. Cortes, M. E., Bonilla J. C., Sinisterra R. D. Biofilm formation, control and novel strategies for eradication  // J. FORMATEX. – 2011. – Р. 896-905.
8. Mah, Thien-Fah C., O’Toole George A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents // J. Microbiology. – 2001. - V. 9, № 1 January. Р. – 34- 39.
9. Myszka K., Czaczyk К. Mechanisms Determining Bacterial Biofilm Resistance to Antimicrobial Factors // Antimicrobial Agents. - Р. 213-238.
10. Rodrigues L. B., Santos L. R., Tagliari V. Z., Rizzo N. N. et al. Quantification of biofilm production on polystyrene by Listeria, Escherichiacoli and Staphylococcus aureus isolated from a poultry slaughterhouse  // Brazilian Journal of Microbiology. – 2010. - V. 41. – P. 1082-1085.