Распространенность микро РНК в интронах и окрестностях генов CGA, FSHB, LHB, TSHB у млекопитающих с формированием различного числа доминирующих фолликулов

Репродуктивная функция человека зависит от комплексных, но строго предопределенных гипоталамо-гипофизарно-гонадных взаимодействий. Фолликулогенез рассматривается как постоянный процесс иерархии фолликулов, при котором одновременно происходит рост и созревание одних фолликулов и атрезия других. Почему  в каждом менструальном цикле женщины в развитие вступают в среднем около 30 фолликулов, а продолжает свое развитие только один - доминирующий фолликул, в то время как у других млекопитающих число доминирующих фолликулов в одном цикле  может быть намного больше десяти?  При этом как число одновременно созревающих доминантных фолликулов, так и число детенышей в помете эволюционно закрепленный признак, относящийся к стойким морфо-физиологическим  характеристикам вида. Например, у мыши одновременно овулирует более 8 фолликулов , начиная с 2-х месячного возраста животного, а у человека один  с 12 лет.  Учитывая, что гены основные  которые регулируют время и число созревающих фоллукуллов - альфа цепь гонадотропного гормона (CGA), фолликулостимулирующий гормон (FSHB), лютеинизирующий гормон (LHB) и тиреотропный гормон (TSHB).  практически  одинаковы у всех млекопитающих, а  такие  значительные различия могут найти отражения в системе регуляции этих генов .  Ранее было показано, что некодирующие белок  участки ДНК транскрибируются  и разные типы РНК принимают активное участие в регуляции активности генов, клеточной дифференцировке, апоптозе и других процессах  (ENCODE,2012; Li J., Zhang Z. 2013;  de Hoon M.,.2015).   Некодирующие последовательности имеют огромный потенциал для продвижения нашего полного понимания биологических процессов при нормальном развитии человека и при различных заболеваниях (Kapranov P. e.a., 2010; St Laurent G. et al., 2012;  Chang T. C. et al. 2015).  Однако, многие закономерности функционирования и распределения регуляторных некодирующих белок последовательностей ДНК в геномах эукариот еще  не найдены. Одним из важных регуляторных элементов транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов  является микро РНК,  которая в значительном количестве, как правило,  локализована в интронах и межгенных пространствах генома.   МикроРНК транскрибируется вместе с геном-мишенью и регулирует его экспрессию. Целью данного исследования было изучение особенностей распространения микроРНК вокруг генов гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси  у млекопитающих  с разным числом доминирующих фоликуллов.   Распространенность микро РНК рассматривали в геномах следующих животных с одним доминирующим фолликулом - Homo sapiens, Ovis aries, Bos taurus, Gorilla gorilla, Macaca mulatta , Pan troglodytes  Pongo abelii, Ovis aries. Животных с двумя и более числом доминирующих фолликул - Сanis lupus, Mus musculus, Oryctolagus cuniculus, Sus scrofa , Rattus norvegicus.

Материалы и методы

 В геномах  животных исследовали  локализацию микроРНК в интронах и  цис-регуляторных районах генов - альфа цепи гонадотропного гормона (CGA), фолликулостимулирующего гормона (FSHB), лютеинизирующего гормона (LHB) и тиреотропного гормона (TSHB). Все последовательности были извлечены из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) помощью набора скриптов разработанного нами набора IFITCH. Последовательности микроРНК для поиска гомологов были взяты из базы данных miRBase (http://mirbase.org/). Биоинформационный анализ осуществлялся с помощью GLAM2  и разработанного нами программного обеспечения  Mscanner (Shkurat e.a.,2015).   Результаты первоначального поиска GLAM2 фильтровали с получением только тех последовательностей в которых степень гомологии х нуклеотидов была больше  85 %,   как для пре-микро РНК, так и для зрелой микро РНК.  В таблице 1 показана длина в п.н.  окрестностей  и  генов альфа цепи гонадотропного гормона (CGA), фолликулостимулирующего гормона (FSHB), лютеинизирующего гормона (LHB) и тиреотропного гормона (TSHB).

Таблица 1.

Длина в п.н.  генов CGA, FSHB, LHB,  TSHB и их окрестностей (межгенное пространство до гена, после гена, интроны и экзоны гена

 у различных млекопитающих

 Результаты исследований

         В результате биоинформационного анализа на участках с общей длинной более 4 миллионов пар нуклеотидов было обнаружено 5967 совпадений с последовательностями зрелых микроРНК, зарегистрированных в базе данных miRBase.  Зрелые микроРНК (шпильки) обнаружены у всех исследуемых животных.  В цис-регуляторных районах  гена CGA у животных с формированием одного доминантного  фолликула расположено от 167 до 262 зрелых микроРНК, что практически в два раза больше по сравнению с группой животных имеющих два и более одновременно созревающих фолликулов(n=68-130).  В гене FSHB у животных с формированием одного доминантного  фолликула расположено от 267 до 367 зрелых микроРНК, что существенно превышает эти значения  в группе животных  с большим числом доминантных фолликул (n=99- 217).  У всех животных вокруг гена  LHB локализовано от 1 до 9 молекул микроРНК, а вокруг гена  TSHB от 11 до 219,  при  этом не обнаружено зависимости их количества  от числа созревания доминирующих фолликулов (таблица 2) .

Таблица 2.

Число локализованных микро РНК вокруг генов гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси некоторых млекопитающих

         Обнаружена высокая корреляция числа микро РНК и  показателями репродуктивной системы  (таблица 3). Расчет коэффициентов корреляции  позволил установить зависимости между числом найденных зрелых микроРНК в окрестностях генов CGA и FSHB и показателями  репродуктивной системы.          Число локализованных молекул микроРНК вокруг гена CGA у всех исследуемых животных  положительно коррелировалось с   продолжительностью беременности  r=0,89; весом при рождении  r= 0,86;  интервалом между родами  r= 0,79 и    с продолжительностью жизни вида  r= 0,7.    Отрицательная корреляция обнаружена с  продолжительностью овуляции(эструса) r=-0,83;  количеством детенышей  в выводке r=-0,82 ; количеством выводков в год r=-0,74.

         Число локализованных молекул микроРНК вокруг гена FSHB  положительно коррелировалось с  возрастом начала  половой зрелости у самок r=0,77;  интервалом между родами, r=0,87;  количеством выводков в год r= 0,74, продолжительностью жизни r=0,79;  продолжительностью цикла r=0,678.

Таблица 3

Коэффициенты корреляции между числом микро РНК в окрестностях генов CGA, FSHB, LHB,  TSHB и  морфо- физиологическими показателями репродуктивной системы вида

         Наибольшее число корреляционных зависимостей между показателями репродуктивной системы и  числом локализованных микро РНК в межгенном пространстве   обнаружено с геном CGA. Ген  CGA  кодирует альфа цепь  для четырех гормонов – фолликулостимулирующего(FSH) , лютеинизирующего  гормона ( LH) ,  тиреотпропного  TSH и хорионического гонадотропина  (CG).  Рассмотрим подробно типы микро РНК локализованные вокруг этого гена.

Вокруг гена CGA  у приматов локализуется более 200 микро РНК.  В таблице 4  представлены наиболее часто встречаемые молекулы.

Таблица 4

Количество молекул  mir-566;  mir-1268;  hsa-mir-3929; hsa-mir-1273e; hsa-mir-5096 локализованных  вокруг гена CGA у приматов

            Как видно из таблицы у всех исследуемых приматов в межгенном пространстве и интронах мы обнаруживали хотя бы одну  копию зрелого  гена  hsa-mir-566.  Ранее  было показано,   что в интронах приматов  локализуется мотивы гомологичных  последовательностей  шпильки   hsa-mir-566 или hsa-мир-619.  Процент встречаемости hsa-mir-566 от общего числа всех типов миРНК локализованных в интронах генов  человека составлял  45.34% (Hill A. E., Sorscher E. 2012). Высокая  копийность генов hsa-mir-5096 и hsa-mir-1268 была нами обнаружена ранее, при анализе распространенности микро РНК у приматов вокруг генов оси соматоропина  - GH1, GHRH, SST, и  IGF1 (Shkurat T. et al., 2015).  Более вероятно, что специфическое значения для времени и числа созревания фолликулов будут иметь гены микро РНК  hsa-mir-3929; hsa-mir-1273e;  а также другие , которые встречались  однокопийно, и роль которых в регуляции фолликулогенеза необходимо будет подтвердить в дальнейшем экспериментально.

       Открытия в течении последнего десятилетия показывают, что РНК  работает не только  как функциональный  посланник между ДНК и белком, но также участвует в регуляции  и организации генома, в  регуляции экспрессии генов, и ее роль увеличивается с усложнением (увеличением сложности)  организма (Hill A. E. et., 2005) .   Показана  важная роль РНК  в эпигенетических процессах, которые контролируют дифференциацию и развитие. Эти открытия показывают, что РНК, кажется,  играет  центральную роль  в эволюции и онтогенезе человека (Оловников, 2007; 2009) .  Очевидно и  микроРНК выполняют важную регуляторную роль в процессе фолликулогенеза.

         Работа выполнена  на оборудовании ЦКП «Высокие технологии» ЮФУ при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской федерации,  проект RFMEF159414X0002.

Список используемой литературы

1. Оловников А. М. Роль парагенома в развитии организмов //Онтогенез. – 2007. – Т. 38. – №. 2. – С. 136-158.
2. Оловников А. М. Биологическая эволюция на основе неслучайной изменчивости, регулируемой организмом //Биохимия. – 2009. – Т. 74. – №. 12. – С. 1722-1728.
3. Chang T. C. et al. Genome-wide annotation of microRNA primary transcript structures reveals novel regulatory mechanisms //Genome research. – 2015.
4. Hill A. E., Sorscher E. J. Massive microRNA sequence conservation and prevalence in human and chimpanzee introns //genome. – 2012. – Т. 3079. – №. 32884. – С. 698069.
5. Kapranov P. et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is' dark matter'un-annotated RNA //BMC biology. – 2010. – Т. 8. – №. 1. – С. 149.
6. de Hoon M., Shin J. W., Carninci P. Paradigm shifts in genomics through the FANTOM projects //Mammalian Genome. – 2015. – Т. 26. – №. 9-10. – С. 391-402.
7. St Laurent G. et al. Intronic RNAs constitute the major fraction of the non-coding RNA in mammalian cells //BMC genomics. – 2012. – Т. 13. – №. 1. – С. 504.
8. Li J., Zhang Z. miRNA regulatory variation in human evolution //Trends in Genetics. – 2013. – Т. 29. – №. 2. – С. 116-124.
9. Shkurat, T., Romanov, D., Pshenichnyy, E., Ponomareva, N., Alexsandrova, A., Bakhtadze, G., & Lomteva, S. (2015). Prevalence of miRNAs in Introns and Cis-Regulatory Regions of Genes of the Somatotropic Axis in Mammals. //American Journal of Applied Sciences. – 2015. – Т. 12. – №. 1. – С. 1.