Исследование терморезистентности и антагонистических свойств дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Введение

В основе формирования качества хлеба лежит совокупность сложных преобразований сырья под действием микроорганизмов и ферментов, которые либо уже присутствуют в перерабатываемых рецептурных компонентах, или специально использованы в технологическом процессе. То есть качество хлебобулочных изделий зависит от хлебопекарных свойств муки, дрожжей, другого сырья, состояния и изменения их углеводно-амилазного, белково-протеинового и липидно-липазных комплексов в ходе технологического процесса, а также жизнедеятельности микроорганизмов [1].

В последнее время тенденция увеличения поставок муки с низкими хлебопекарными свойствами существенно увеличилась. Хлебозаводы и пекарни вынуждены перерабатывать пшеничную муку, химический состав и качество которой колеблется в разных партиях. Это влияет, в первую очередь, на свойства хлебопекарных полуфабрикатов, интенсивность протекания коллоидных, биохимических и микробиологических процессов при изготовлении теста и его разделении, и в конечном итоге, на показатели качества готовых изделий [1, 5].

Изучение и возможность применения антибактериальных соединений, которые выделяются дрожжами, находятся на ранней стадии развития. Антагонизм дрожжей по отношению к различным микроорганизмам связан в первую очередь с борьбой за питательные вещества в среде обитания. Он проявляется за счет изменения рН среды в результате ионного обмена или синтеза органических кислот, производства высоких концентраций этанола, выделение антибактериальных соединений и киллерных токсинов. Открытие антангонистических свойств дрожжей находит широкое применение во многих отраслях, таких как пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина, ветеринария, охрана окружающей среды [6, 10].

Считается, что гибель дрожжей начинается уже при 45—50° С, а при 90—95° С они полностью погибают. Однако согласно последним литературным данным, клетки сахаромицетов при таких температурах не полностью погибают, а лишь получают сублетальные повреждения и теряют способность к росту на питательных средах. Поэтому истинное количество клеток в пищевом продукте может быть недооценено [8].

Цель работы

Исследование терморезистентности и антагонистической активности дрожжей S. cerevisiae и их метаболитов по отношению к различным группам микроорганизмов.

Материалы и методы

Объекты исследований

Исследование антагонистических свойств метаболитов дрожжей проводили, используя следующие образцы хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae:

-       прессованные дрожжи ТМ «Львовские дрожжи»;

-       прессованные дрожжи ТМ «Криворожские дрожжи»;

-       сухие активные дрожжи ТМ «Саф-Левюр»;

-       дрожжи, выделенные из хлеба, испеченного в лабораторных условиях с содержанием дрожжей 2, 4 % по рецептуре;

-       дрожжи, выделенные из хлеба на хмелевой закваске;

-       дрожжи, выделенные из батона «Нива», с содержанием дрожжей 1, 5 % по рецептуре;

-       дрожжи, выделенные из батона «Киевский», с содержанием дрожжей 3 % по рецептуре;

-       дрожжи, выделенные из хлеба зернового «Молодость», который испечен на зерновой закваске без дрожжей.

Для определения способности клеток дрожжей выживать при температуре выпекания хлеба использовали: хлеб с содержанием 2, 4 % прессованных и 0, 8 % сухих дрожжей, мякиш которого вносили в солодовый экстракт с и без добавления NaCl, хлеб с содержанием 1 %, 5 % и 3 % дрожжей, мякиш которого вносили в горькую заварку.

Замес теста и формование изделий лабораторных образцов проводили вручную. Температура выпекания 200—220° С, время выпекания 40—45 мин.

Для определения количества живых дрожжевых клеток в хлебе из торговой сети использовали следующие образцы:

-       ржаной бездрожжевой цельнозерновой хлеб ТМ «Милльвиль»;

-       хлеб ржаной бездрожжевой на хмеле ТМ «Ржаная сила».

Для определения антагонистических свойств дрожжей, их метаболитов, полуфабрикатов и хлеба использовали следующие тест-культуры музея кафедры биотехнологии и микробиологии: Staphylococcus aureus БМС-1, Escherichia coli ИЭМ-1, Bacillus subtilis БТ-2, Enterobacter cloacae БТ-4, Penicillium chrysogenum Ф-7, Aspergillus niger Р-3.

Методы микробиологических исследований

Для выявления антагонистических свойств дрожжей по образованию зон задержек роста тест-культур использовали метод перпендикулярных штрихов и метод бумажных дисков [2].

Метод перпендикулярных штрихов. Среды (сусло-агар, Сабуро, ГКА, пептон-глюкозный дрожжевой агар) разливали в чашки Петри и инкубировали сутки в термостате для проверки микробиологической чистоты сред. По всей длине чашки высевали сплошной линией один из исследуемых образцов дрожжей. Штрихом, перпендикулярно к линии роста дрожжей, начиная от периферии чашки, подсевали тест-культуры. Чашки Петри выращивали в термостате при 30° С в течение 3 сут. Тест-культуры (S. aureus, E. coli, B. subtilis, E. cloacae) использовали односуточные [2].

Метод бумажных дисков. Производственные расы хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae в количестве 3 % вносили в колбы на 750 мл с 150 мл стерильной питательной среды (NaCl 0,5 %, глюкоза 5 % на 1 л воды). Культивирование проводили в течение 48 ч на качалках (320 об/мин) при 30°С. Пробы центрифугировали для получения надосадочной (активные метаболиты) и осадочной фракции (клетки дрожжей) [2].

Тест-культуры высевали сплошным газоном на среду Сабуро. Затем поверх посева устанавливали стерильные диски фильтровальной бумаги, смоченные в биологические пробы (надосадочную и осадочной жидкости). Инкубировали при 37  С двое суток при комнатной температуре. После этого проводили измерения диаметра задержки роста тест-культур.

Восстановление сублетально поврежденных клеток дрожжей. Опытные образцы хлеба разрезали пополам и вынимали мякоть весом 10 г. Половину мякоти вносили в 45 мл солодового бульона, а другую — в солодовый бульон с добавлением NaCl. Культивирование проводили в течение 24 ч при температуре 30° С. Пробы отбирали на 4, 18 и 24 ч культивирования в количестве 1 мл с последующим посевом глубинным способом на среды сусло-агар и солодовый агар. Среды содержали антибиотик стрептомицин. Чашки Петри помещали в термостат и выдерживали при температуре 30°С, подсчет восстановленных клеток дрожжей проводили через 3 сут. [1].

Результаты и обсуждение

В случае, если микроорганизмы подвергаются экологическим стрессам, таким как действие высокой или низкой температуры, то отдельные клетки получают метаболические повреждения и, как следствие, становятся неспособными формировать колонии на селективных питательных средах. В то же время не поврежденные клетки могут быть толерантными. Поэтому для восстановления поврежденных клеток используют специальные восстанавливающие среды [9].

Сублетально поврежденным микроорганизмам присущи задержки в стадиях роста, повышенная чувствительность к различным агентам селективной питательной среды, повреждения мембран, ДНК и ферментов цикла трикарбоновых кислот, разрушение рибосом. Повреждение рибосом и клеточных мембран проявляется как обычное следствие повреждения высокой температурой [7, 10].

Поэтому на первом этапе работы по исследованию способности дрожжевых клеток выживать при температуре выпекания хлеба использовали горькую заварку (с добавлением 1 % хмелевого отвара), в которую вносили мякиш опытных образцов хлеба, выпеченных с добавлением 1, 5 % и 3 % дрожжей и без них. Заварка служила питательной средой для сублетально поврежденных клеток.

Следует указать, что при проведении микробиологического анализа заварок и хлеба перед началом опыта, дрожжевых клеток в них не обнаружили.

В ходе эксперимента было установлено, что после 24 ч брожения заварка с внесением мякиша из бездрожжевого хлеба не содержит жизнеспособных клеток дрожжей. Она имеет приятный медовый запах, признаки брожения и контаминации отсутствуют.

В заварке с хлебом, который выпечен с добавлением 1, 5 % и 3 % дрожжей к массе муки, их количество составляло 1 × 10² и 1 × 10³ КОЕ / г соответственно. В первом образце отмечено появление неприятного гнилостного запаха и посторонних микроорганизмов, незначительное увеличение в объеме, что свидетельствует о начале брожения. Второй образец имел спиртовой запах, а объем заварки в результате брожения увеличился вдвое.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности клеток дрожжей оставаться жизнеспособными в хлебе после воздействия на них высоких температур выпекания.

Следующим этапом работы по восстановлению сублетально поврежденных клеток дрожжей стало использование в качестве восстанавливающей среды солодового экстракта, в который вносили мякиш хлеба с последующим выдерживанием в нем в течение 3 ч. Затем 0, 2 мл исследуемой суспензии высевали на питательную среду сусло-агар. В качестве образцов использовали хлеб, выпеченный с добавлением 1, 5 и 3 % прессованных дрожжей к массе муки.

Установлено, что в мякоти обоих образцов хлеба содержится 1—2 КОЕ/г дрожжей. Анализируя полученные результаты, было сделано предположение, что время выдержки опытных образцов хлеба в солодовом экстракте не является достаточным для восстановления сублетально поврежденных клеток дрожжей. Поэтому было увеличена продолжительность выдержки мякиша опытных образцов хлеба до 24 ч с последующим отбором проб через 4 и 18 ч.

Через 4 ч выдержки хлеба в солодовом экстракте, роста клеток дрожжей на сусло-агаре не обнаружено. Анализ результатов исследования образцов через 18 ч показал, что после высева 1 мл суспензии с первого образца хлеба, изготовленного с добавлением 1, 5 % дрожжей на сусло-агаре выросло 2—4 КОЕ, а со второго (хлеб, испечённый с добавлением 3 % дрожжей) — 6—8 КОЕ. Микробиологический контроль исследуемых объектов через 24 ч культивирования показал, что количество дрожжей на чашках Петри составляло соответственно 3—5 КОЕ и 8—9 КОЕ.

Для проверки терморезистентности дрожжей, кроме хлеба, выпечённого в лабораторных условиях, были использованы образцы хлеба, приобретенные в торговой сети (рисунок 1.).

Рисунок 1 — Содержание дрожжей в хлебе из торговой сети

Анализ исследований показал, что наибольшее количество живых клеток дрожжей было обнаружено в батоне «Киевский», с содержанием прессованных дрожжей 3 % по рецептуре, испечённого безопарным способом. Наименьшее количество — в хлебе, изготовленного на хмелевой закваске. Хлеб использовали сразу после приготовления.

Следует отметить, что проведенные исследования содержания дрожжей в хлебе промышленного производства через 24 и 48 ч хранения жизнеспособных клеток дрожжей не обнаружили.

При микроскопировании выделенных образцов дрожжей, которые выросли на сусло-агаре обнаружено, что они имеют значительно меньшие размеры, чем обычные сахаромицеты (рисунок 2.)

Рисунок 2 — Сравнение размеров выделенных дрожжей: 1 — дрожжи, которые обнаружены в батоне «Нива», 2 — дрожжи, которые обнаружены в батоне «Киевский», 3 — Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи, выделенные из хлеба на хмеле, отличались по своим культуральным признакам, поскольку их колонии были не белого, а кремового цвета, а клетки под микроскопом имели достаточно большие размеры (рисунок 3).

Рисунок 3 — Дрожжи, выделенные из хлеба на хмелевой закваске

Проведенные исследования по определению видовой принадлежности, по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим признакам по сбраживанию углеводов подтвердили, что все дрожжи, выделенные из различных образцов хлеба, относятся к S. cerevisiae (таблица 1)

Таблица 1 — Сбраживание углеводов выделенными дрожжами

Для подавления роста бактерий и лучшего восстановления дрожжей в солодовый экстракт предложено вносить соль в количестве 10 % от общего объема. В качестве опытных образцов использовали хлеб, выпеченный в лабораторных условиях с добавлением 2, 4 % прессованных и 0, 8 % сухих дрожжей.

Как известно NaCl используют в качестве пищевого консерванта. Соль способна ингибировать рост бактерий: сначала клетка подвергается плазмолизу, что подавляет ее рост, а потом и вовсе погибает. Ингибирующий эффект соли не зависит от значения рН. Большинство не морских бактерий погибает при 20 % или даже меньшей концентрацией NaCl, тогда как плесневые грибы и дрожжи переносят высокую концентрацию, которая в некоторых случаях является стимулятором роста клеток [2, 4]. Соль оказывает защитное влияние на эти микроорганизмы, вследствие снижения активности воды (аw) и повышения термостойкости микроорганизмов по механизму, который аналогичен высушиванию.

В опыте по выявлению живых клеток дрожжей в качестве образца использовали хлеб, выпеченный с добавлением 2, 4 % прессованных дрожжей, с последующим выдерживанием его 1, 5 часа в солодовом экстракте с добавлением соли. На чашке Петри были выделены 14 КОЕ дрожжей. Колонии изолированных клеток дрожжей были окрашены в розовый цвет, имели ровную поверхность, правильные края (рисунок 4).

Рисунок 4 — Колонии дрожжей, выделенных из хлеба выпеченого в лабораторных условиях

Следует отметить тот факт, что восстановление поврежденных клеток дрожжей, которые выдерживались в солодовом экстракте с добавлением соли, началось в 2 раза быстрее, нежели без внесения NaCl.

В хлебе, испечённом с добавлением 0, 8 % сухих дрожжей от массы муки, клеток дрожжей выделено не было. Вероятно, это связано с небольшим процентом дрожжей в хлебе.

Чтобы проверить способность дрожжевых клеток выживать при температуре выпекания хлеба, и как следствие их термостойкость, были выбраны следующие образцы хлеба, приобретенные в торговой сети:

-            ржаной бездрожжевой цельнозерновой хлеб ТМ «Милльвиль»;

-            хлеб ржаной бездрожжевой на хмелю ТМ «Ржаная сила».

В ходе эксперимента сублетально поврежденных клеток дрожжей выделено не было. Дрожжи в данных образцах оказались не устойчивыми к высоким температурам выпекания.

На следующем этапе роботы были исследованы антагонистические свойства дрожжей S. cerevisiaе и их метаболитов в отношении различных тест-культур методом бумажных дисков на среде Сабуро (рисунок 5).

Рисунок 5 — Зоны задержек роста тест-культур: 1 — В. subtilis; 2 — E. сloaceae 

В качестве объектов исследований были выбраны прессованные дрожжи торговых марок «Криворожские дрожжи» ООО «Лесаффр Украина» и «Львовские дрожжи» ЗАО «Компания Энзим», сухие активные дрожжи ТМ «Саф-ЛЕВЮР» и дрожжи, которые выделили из хмелевого хлеба.

Образцы дрожжей культивировали в среде с глюкозой и NaCl в течение 48 ч. Пробы отбирали на 6, 24 и 48 ч культивирования (таблица 2.).

Таблица 2 — Значение рН исследованных проб суспензии дрожжей 

Следует отметить, что S. cerevisiae имели антагонистическую активность по отношению ко всем тест-культурам, задержку роста E. сloaceae вызвали S. cerevisiae, на основе которых изготовлены сухие активные дрожжи. Степень выраженности антаногизма была слабая и средняя (таблицы 3, 4.).

Таблица 3 — Значение диаметров задержки роста тест-культур для прессованных дрожжей

Таблица 4. — Значение диаметров задержки роста тест-культур для сухих и выделенных из хлеба дрожжей

Прессованные дрожжи обеих торговых марок обладают почти одинаковой антагонистической активностью по отношению к тест-культурам. Отмечено, что расы хлебопекарных дрожжей не вызывают задержек роста бактерий E. cloaceae, что в случае высокой концентрации в организме человека отрицательно влияют на состояние его здоровья. Клетки дрожжей и их метаболиты по-разному влияют на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Наибольшую активность, связанную с угнетением роста тест-культур, образцы прессованных дрожжей проявляли на 6 ч культивирования, 48 ч культивирования характеризовался значительным спадом активности как живых клеток S. cerevisiae так и их метаболитов.

Если сравнивать между собой сухие дрожжи и дрожжи, выделенные из хлеба на хмелевой закваске, то сухие дрожжи обладают большей антагонистической активностью к таким тест-культур как В. subtilis, S. аureus и E. сloaceae. По отношению к E. coli активность почти одинакова в обоих образцах. Наибольшие задержки диаметров роста тест-культур приходятся на 6 ч культивирования.

Наиболее активными антагонистами являются сухие дрожжи и их метаболиты. Зоны задержки роста тест-культур, образованные данным дрожжами, значительно отличаются от других. Также как видно из таблиц 3 и 4, живые клетки дрожжей и их метаболиты по-разному действуют на грамположительные и грамотрицательные клетки во всех исследуемых образцах хлебопекарных дрожжей.

Таким образом, в отношении грамположительных тест-культур S. аureus и В. subtilis наибольшую антагонистическую активность проявляют живые клетки дрожжей на 6 и 24 ч культивирования. Вероятно, это связано с тем, что в ходе своей жизнедеятельности дрожжи способны вырабатывать вещества с антимикробной активностью (бактериоцины) и избирательно подавлять жизнедеятельность микроорганизмов за счет ингибирования клеточного метаболизма [3, 4]. Антагонистическая активность осадочной и надосадочной фракций S. cerevisiae по отношению к E. coli была наибольшей в период уменьшения роста культуры, то есть на грамотрицательные культуры влияли метаболиты, полученные в результате гибели дрожжевых клеток. Но антагонистическая активность была слабой, а по отношению к E. сloaceae со стороны прессованных дрожжей, вообще отсутствовала.

Итак, лизированные клетки дрожжей выделяют в окружающую среду биологически активные вещества и низкомолекулярные продукты жизнедеятельности, в качестве которых могут выступать гидролитические ферменты, не использованные запасные вещества, накопленные токсины и другие продукты метаболического обмена, способствующие угнетению роста бактерий [3, 4]. Действие метаболитов дрожжей и лизированных дрожжевых клеток на грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы разное. Поэтому лизаты культур дрожжей представляют собой перспективный материал для дальнейших исследований.

Вывод

1. Полученные результаты свидетельствуют о возможности клеток дрожжей оставаться жизнеспособными в хлебе после воздействия на них высоких температур выпекания.
2. Показано, что лизированные клетки дрожжей, выделенные из различных товарных форм, продуцируют биологически активные вещества и низкомолекулярные продукты их жизнедеятельности, которые способны подавлять рост грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.
3. Выявлено, что наиболее активными антагонистами по отношению к рассматриваемым тест-культурам является S. cerevisiae из сухих дрожжей.
4. Живые клетки дрожжей, которые были выделены из сухой товарной формы проявляют антагонистическую активность по отношению к грамположительным микроорганизмав в 3 раза выше, а метаболиты — в два раза больше по отношению к грамнегативным, по сравнению с прессованными дрожжами.

Литература

1. Афанасьева О.В. Микробиология хлебопекарного производства. — СПб.: Береста, 2003. — 220 с.

2. Блекберн К. де В. Микробиологическая порча пищевых подуктов — М.: Профессия, 2008.— 784 с.

3. Баснакьян И.А., Ожован И.М., Арэманян В.Г. Киллерные токсины клинически значимых дрожжей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2002. — № 4. — С. 79—83.

4. Толсторуков И.И., Зимина М.С., Казанцева Д.И. Киллер-фактор К2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae M437 обладает широким видовым спектром действия // Биотехнология. — 1989. — №5 (3). — С. 295—302.

5. Мовсарова З.Х. Повышение качества хлебобулочных изделий на основе регулирования биотехнологических свойств дрожжей: дис. ... канд. техн. наук : 05.18.01 / Мовсарова З.Х. — М., 2006. — 187 с.

6. Фролова Я.Н. Антагонистическая активность метаболитов Saccharomyces cerevisiae к симбиотическим микроорганизмам кишечника человека // Альманах современной науки и образования. — 2009. — Т. 30, № 11. — С. 197—199.

7. Nitroomand F., Sperber W.H., Lewandowski V.J. Fate of bacterial pathogens and indicator organisms in liquid sweeteners // J. Food Proteck. — 2009. — № 61. — P. 295—299.

8. Phaff H.J., Miller M.W., Mrak E.M. The life of yeasts. — 2^th ed. — Cambridge: Harvard Univ. Press, 2000. — 206 с.

9. Postgate J.R., Hunter J.R. Metabolic injury in frozen bacteria // J. Appl. Bacteriol. — 2007. — 26. — Р. 405—414.

10. Rose A.H., Harrison J.S. Biology of yeasts. — London: Acad. Press, 2003. — 116 с.

11. Tomlins R.I., Pierson M.D., Ordal Z.J. Effekt of thermal injury on the TCA cycle enzymes // J. Microbiol. — 2011. — 17. — Р. 759—765.

12. Zerva L., Hollis RJ. Handbook of Food Science, Technology, and Engineering. — New York: Taylor Group, 2011. — 152.

Literature

1. Afanas'eva O.V. Mikrobiologiya xlebopekarnogo proizvodstva. — SPb.: Beresta, 2003. — 220 s.

2. Blekbern K. de V. Mikrobiologicheskaya porcha pishhevyx poduktov — M.: Professiya, 2008.— 784 s.

3. Basnak'yan I.A., Ozhovan I.M., Are'manyan V.G. Killernye toksiny klinicheski znachimyx drozhzhej // Zhurnal mikrobiologii, e'pidemiologii i immunobiologii. — 2002. — № 4. — S. 79—83.

4. Tolstorukov I.I., Zimina M.S., Kazanceva D.I. Killer-faktor K2 drozhzhej Saccharomyces cerevisiae M437 obladaet shirokim vidovym spektrom dejstviya // Biotexnologiya. — 1989. — №5 (3). — S. 295—302.

5. Movsarova Z.X. Povyshenie kachestva xlebobulochnyx izdelij na osnove regulirovaniya biotexnologicheskix svojstv drozhzhej: dis. ... kand. texn. nauk : 05.18.01 / Movsarova Z.X. — M., 2006. — 187 s.

6. Frolova Ya.N. Antagonisticheskaya aktivnost' metabolitov Saccharomyces cerevisiae k simbioticheskim mikroorganizmam kishechnika cheloveka // Al'manax sovremennoj nauki i obrazovaniya. — 2009. — T. 30, № 11. — S. 197—199.

7. Nitroomand F., Sperber W.H., Lewandowski V.J. Fate of bacterial pathogens and indicator organisms in liquid sweeteners // J. Food Proteck. — 2009. — № 61. — P. 295—299.

8. Phaff H.J., Miller M.W., Mrak E.M. The life of yeasts. — 2^th ed. — Cambridge: Harvard Univ. Press, 2000. — 206 с.

9. Postgate J.R., Hunter J.R. Metabolic injury in frozen bacteria // J. Appl. Bacteriol. — 2007. — 26. — Р. 405—414.

10. Rose A.H., Harrison J.S. Biology of yeasts. — London: Acad. Press, 2003. — 116 с.

11. Tomlins R.I., Pierson M.D., Ordal Z.J. Effekt of thermal injury on the TCA cycle enzymes // J. Microbiol. — 2011. — 17. — Р. 759—765.

12. Zerva L., Hollis RJ. Handbook of Food Science, Technology, and Engineering. — New York: Taylor Group, 2011. — 152.