Изменение уровней УФ-индуцированного мутагенеза при комбинации мутаций по генам, кодирующим белки-модификаторы хроматина, с мутацией rad54 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Введение 

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae белок Rad52 является ключевым в процессе проведения репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинационной репарации (ГРР) [9]. Белок Rad54 индуцируется в ответ на ДНР ДНК, но привлекается на более поздних стадиях ГРР, чем Rad52p. Мутанты по гену RAD54 отличаются повышенной чувствительностью к летальному действию гамма-лучей и ультрафиолета (УФ) [9, 11]. 

Ранее нами установлено, что частоты спонтанного мутирования изменяются при комбинациях мутаций hsm3 и hsm6 с мутацией rad52 [6]. Как показано в наших предыдущих работах, продукт гена HSM3 принимает участие в стабилизации основного интермедиата пострепликативной репарации (ПРР) и ГРР — D-петли [4, 5].

Ген HSM6 идентичен гену PSY4 [3]. Мутации в этом гене влияют на мутационный процесс примерно так же, как и мутации hsm3. Белок Psy4 входит в состав трехсубъединичного фосфатазного комплекса Pph3—Psy2—Psy4, биохимическая функция которого состоит в дефосфорилировании гистона γН2А [3]. При этом никаких изменений в частотах спонтанного мутирования при комбинации мутаций hsm3 и hsm6 с мутацией rad54 выявлено не было.

Ген DOT1 дрожжей S. cerevisiae кодирует гистон-метилазу, принимающую участие в модификации структуры хроматина в процессе чекпойнта, а также при репарации ДНР ДНК [8, 13].

Ген ASF1 кодирует белок Asf1, отвечающий за сборку-разборку нуклеосом и структуры хроматина, а также способный влиять на уровень пула дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) в клетке [10, 14]. Мутанты asf1 характеризуются замедленным ростом и повышенной чувствительностью к летальному действию ряда мутагенов [10].

В данной работе мы показали, что наблюдается изменение уровней УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости при комбинации мутаций hsm6, dot1 и asf1 с мутацией rad54.

Материалы и методы

Штаммы

Генотипы штаммов S. cerevisiae, использованных в работе, приведены в таблице 1. Одиночные мутанты (нуль-аллели) rad52, rad54, dot1, asf1 были получены замещением соответствующих генов в штамме дикого типа (2D-3034) при помощи вставки маркерных генов ауксотрофных потребностей, а также генетициновой (GEN) и NAT-кассет, в рамки считывания исходных генов в штамме дикого типа (см. Таблицу). Одиночный мутант hsm6 происходит из генетической коллекции лаборатории. Двойные мутанты dot1rad52, dot1rad54, hsm6rad52, hsm6rad54, asf1rad52 и asf1rad54 были получены делетированием геновRAD52 и RAD54, в указанных выше одиночных мутантах. Корректность вставок контролировалась при помощи ПЦР с использованием комбинаций двух внешних и/или внешнего и внутреннего праймеров для каждого из указанных генов, что позволяет контролировать фланги и замещение гена внутри рамки считывания.

Таблица 1 — Генотипы штаммов дрожжей, использованные в работе 

Среды

В работе использовались стандартные среды полного и минимального состава [1]. При работе с ауксотрофными мутантами в минимальную среду добавляли необходимые для роста метаболиты из расчета 20 мг/л для аминокислот и 3 мг/л для азотистых оснований. При учете частоты индуцированных мутаций по пяти ADE локусам использовалась среда со спиртом, состав которой описан ранее в [2].

Мутационные тесты

Источником УФ-лучей служила лампа БУФ-30П с мощностью дозы 1, 4 Дж/м²сек. Чувствительность к летальному действию УФ лучей определяли, снимая кривые выживаемости в зависимости от дозы [2]. Чувствительность к мутагенному действию УФ лучей определяли по индукции прямых мутаций в пяти ADE локусах (ADE4—ADE8) [12]. Было поставлено не менее 4—5 повторностей каждого опыта, на графиках приведены средние значения частот с 95 % доверительными интервалами.

Результаты и обсуждение

Нами проведены тесты чувствительности одиночных (штамм дикого типа (wt), rad52, rad54, hsm6, dot1, asf1) и двойных (dot1rad52, dot1rad54, hsm6rad52, hsm6rad54, asf1rad52 и asf1rad54) мутантов к летальному и мутагенному действию УФ лучей.

На рисунке 1 представлены графики УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости для штаммов wt, rad52, rad54, dot1, dot1rad52, dot1rad54. Как видно из рисунка 1, одиночные мутанты rad52, rad54, и dot1 и двойной мутант dot1rad52 отличаются по уровню УФ-индуцированного мутагенеза незначительно от штамма дикого типа (wt). При этом выживаемость одиночного мутанта dot1 снижена по сравнению с wt при средних дозах облучения. Двойной мутант dot1rad54 по чувствительности к летальному действию УФ лучей статистически не отличается от одиночных родительских мутантов dot1 и rad54, однако уровень мутагенеза, индуцированного УФ, отличается от штамма дикого типа в 15—20 раз, и в 7—8 раз от одиночных родительских мутантов.

На рисунке 2 представлены графики УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости для штаммов wt, rad52, rad54, hsm6, hsm6rad52, hsm6rad54. Как видно из рисунка 2, одиночные мутанты hsm6, rad52 и rad54 статистически близки по уровню УФ-индуцированного мутагенеза и отличаются от штамма дикого типа в 2 раза. При этом двойной мутант hsm6rad52 по уровню мутагенеза, индуцированного УФ лучами, отличается в 3—4 раза от контрольного штамма wt и в 2—2, 5 раза от одиночных родительских мутантов hsm6 иrad52. Двойной мутант hsm6rad54 показал значительное увеличение уровня УФ-индуцированного мутагенеза (5—6 раз по сравнению со штаммом дикого типа и 3—4 раза по сравнению с родительскими штаммами), более чем 10-кратное падение выживаемости по сравнению с контрольным штаммом и более чем 5-кратное по сравнению с исходными одиночными мутантами.

На рисунке 3 представлены графики УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости для штаммов wt, rad52, rad54, asf1, asf1rad52, asf1rad54. Как видно из рисунка 3, одиночный мутант asf1 отличается от контрольного штамма сниженной жизнеспособностью при средних и больших дозах облучения УФ (в 8—10 раз). При этом обладает повышенным уровнем УФ-индуцированного мутагенеза (в 7—8 раз выше, чем у штамма дикого типа). Летальность также сильно повышена у двойного мутанта asf1rad54: более чем в 10—12 раз по сравнению со штаммом wt, и более чем в 3—5 раз по сравнению с одиночными мутантами asf1 и rad54. Указанный двойной мутант характеризуется также сверхвысоким мутагенезом (при всех дозах УФ): уровень мутаций в 8—10 раз выше, чем у штамма дикого типа. Следует отметить, что частоты индуцированных мутаций у двойного мутанта asf1rad52 статистически близки к таковым у одиночного мутанта asf1.

Большинство жизненно важных процессов, связанных с ДНК, таких как транскрипция, репликация, рекомбинация и репарация, включают в себя изменения структуры ДНК и организации хроматина. Гистоновые белки образуют кор хроматина, и их пост-трансляционные модификации критичны для регуляции различных матричных процессов, таких как репарация и мутагенез.

Метилирование гистона Н3 является одним из ключевых событий в регуляции репарационных процессов у дрожжей. Одной из таких модификаций является метилирование белком Dot1 лизина 79 (К79) гистона Н3 [8]. В течение роста клеток дрожжей около 90 % нуклеосом содержат метилированный остаток Н3—К79. Штаммы дрожжей, делетированные по гену DOT1, или штаммы, в которых К79 заменен на другую аминокислоту, показывают ярко выраженную радиочувствительность [8, 13]. Монометилирование К79 не индуцируется в ответ на повреждения ДНК, хотя необходимо для ускорения репарационного процесса [13]. Мутация dot1 приводит к увеличенному мутагенезу, индуцированному метилметансульфонатом (ММС), что свидетельствует о том, что Dot1 негативно регулирует мутагенный путь обхода повреждений ДНК. Мутант dot1 более устойчив, чем дикий тип, к высоким дозам ММС. Белок Dot1 требуется также для мейотического и митотического рекомбинационного чекпойнта [8].

Анализ эпистатического взаимодействия гена DOT1 с ключевым геном RAD52, контролирующим ГРР, показал, что УФ чувствительность мутанта dot1 определяется его влиянием на ГРР, так как оба мутанта dot1 и rad52 показали одинаковую чувствительность к мутагену (рисунок 1). Таким образом, наши данные подтверждают полученный ранее результат об участии гена DOT1 в контроле рекомбинационной репарации [8, 13]. В то же время, в случае взаимодействия мутаций dot1 и rad54 мы наблюдали резкое повышение уровня УФ-индуцированного мутагенеза. Известно, что ген RAD54 активируется после RAD52 в механизме ГРР, но, в основном, отвечает за репарацию ДНР ДНК, возникших при УФ облучении клеток [7, 9, 11]. Однако не так давно появились данные о том, что Rad54p является одним из модификаторов структуры хроматина: входит в семейство SWI/SNF транслоказ, изменяющих топологию хроматина в том числе и в случае репарации ДНР ДНК [11]. Мы предполагаем, что изменение шаблона метилирования гистона H3 (при выключении DOT1) и частичная блокировка репарации ДНР по механизму ГРР (при выключении RAD54) приводят к усилению роли ошибочного пути ГРР, что, с одной стороны, повышает выживаемость клеток (большее количество повреждений ДНК репарируется ошибочным синтезом через повреждения), а с другой, как результат, — ведет к сильному росту индуцированного мутагенеза. Такой характер зависимости инактивации клеток может отражать дефект пострепликативной репарации в мутанте dot1, действие которой наиболее выражено у непочкующихся клеток (начальный участок кривой на рисунке 1). В то же время в почкующихся клетках потеря активности пострепликативной репарации компенсируется активацией рекомбинационной репарации.

Ранее нами показано, что ген HSM6 принимает участие в контроле мутационного процесса у дрожжей S. cerevisiae. Мутации вуказанном гене приводят к увеличению скорости спонтанного мутирования, обусловленного репарационным синтезом ДНК. Также наблюдалось увеличение частот мутагенеза, индуцированного различными ДНК повреждающими агентами. Делеция гена RAD52 также увеличивает темпспонтанного мутирования. Комбинация мутаций в этих генах приводит к еще большему уровню спонтанного мутагенеза, что отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток, которая значительно понижена и в одиночном мутанте rad52 [3, 6].

Мы ранее также показали, что ген HSM6 идентичен гену PSY4, белок Hsm6 (Psy4) работает в составе комплекса Pph3-Psy2-Psy4, дефосфорилирующего гистон  γН2А. То есть, Hsm6 также относится к белкам-модификаторам структуры хроматина: мутации hsm6/psy4 изменяют шаблон фосфорилирования-дефосфорилирования Rad53p и γН2А, что отражается на длительности чекпойнта и эффективности репарации ДНК [3].

В данной работе мы показали, что комбинация мутации hsm6 с мутациями rad52 и rad54 приводит к резкому снижению выживаемости (что согласуется с ранее полученными данными) и увеличению уровня индуцированного мутагенеза (рисунок 2). Таким образом, изменение шаблона дефосфорилирования (инактивацияHSM6) вкупе c нарушениями в работе системы ГРР (инактивация RAD52 и/или RAD54) имеет более тяжелые последствия для клетки, чем в предыдущем случае — комбинации мутаций dot1 и rad54.

Ген ASF1 кодирует один из основных факторов сборки нуклеосом, а также сборки-разборки хроматина, в том числе и в случаях чекпойнта и репарации поврежденной ДНК [10, 14]. Мутанты asf1 отличаются замедленной (в 2—4 раза) скоростью роста, повышенной чувствительностью к большинству физических и химических агентов, повреждающих ДНК [14]. Также известно, что Asf1p способен регулировать уровень пула дНТФ в клетке [10].

Наблюдаемая нами картина (рисунок 3) хорошо согласуется со сказанным выше: выживаемость одиночного мутанта asf1 сильно снижена по сравнению со штаммом дикого типа. Мы предполагаем, что Asf1p работает на пути ГРР совместно с Rad52p: из рисунка 3 видно, что частоты индуцированных мутаций у штаммов asf1 и  asf1rad52 статистически совпадают. В двойном мутанте asf1rad52 механизм ГРР полностью блокирован, и бреши в структуре ДНК будут заполняться с использованием ПРР, эффективность которой ухудшена из-за снижения концентрации дНТФ, обусловленного мутацией asf1. При этом время, отводимое на каждый акт репарации, значительно повысится из-за задержки чекпойнта, и будет наблюдаться повышение уровня, как выживаемости, так и УФ-индуцированного мутагенеза. В случае двойного мутанта asf1rad54 снижение выживаемости и увеличение уровня мутирования объясняется переключением на склонный к ошибкам путь ГРР.

Выводы

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что комбинации мутаций основных генов, кодирующим белки-модификаторы хроматиновой структуры — dot1, hsm6 и asf1, с мутацией rad54 приводят к резкому повышению уровня УФ-индуцированного мутагенеза вследствие переключения механизма репарации на ошибочный путь гомологичной рекомбинационной и пострепликативной ветвей, а также снижению выживаемости (в случае двойных мутантов hsm6rad54 и asf1rad54) и изменению времени чекпойнта (мутанты asf1 и asf1rad52). Причем, чем более широкое системное действие имеет модификатор хроматина, тем сильнее для клетки последствия комбинации мутаций в нем с мутацией rad54.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ: проект №12-04-01467-а.

Литература

1. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов // Л. Наука. 1984. 144 с.
2. Ковальцова С.В., Королев В.Г. Штамм дрожжей Saccharomycescerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2 и him1 // 1996. Генетика. Т.32(3). с.366—372.
3. Федоров Д.В., Ковальцова С.В., Евстюхина Т.А., Пешехонов В.Т., Черненков А.Ю., Королев В.Г. // Ген HSM6 идентичен гену PSY4 дрожжей Saccharomycescerevisiae // 2013. Генетика. Т.49(3). с.328—336.
4. Черненков А.Ю., Грачева Л.М., Евстюхина Т.А., Ковальцова С.В., Пешехонов В.Т., Федорова И.В.,  Королев В.Г. // Взаимодействие гена HSM3с генами эпистатической группы RAD6 у дрожжей Saccharomycescerevisiae // 2012. Генетика. Т.48(2). с.160—167.
5. Черненков А.Ю., Федоров Д.В., Грачева Л.М., Евстюхина Т.А., Ковальцова С.В., Пешехонов В.Т., Федорова И.В., Королев В.Г. // Взаимодействие гена HSM3 с генами, инициирующими гомологичную рекомбинационную репарацию у дрожжей  Saccharomycescerevisiae // 2012. Генетика. Т.48(3). с. 333—339.
6. Черненков А.Ю., Федоров Д.В., Косарева А.А., Кожина Т.Н., Королев В.Г. // Изменение частот спонтанного мутагенеза при комбинациях мутаций hsm3 и hsm6 с мутацией rad52 в клетках дрожжей Saccharomycescerevisiae // 2014. Генетика. Т.50(2). с.243—245.
7. Alexeev A., Mazin A., Kowalczykowski S.C. Rad54 protein possesses chromatin-remodeling activity stimulated by the Rad51-ssDNA nucleoprotein filament // 2003. Nat. Struct. Biol. 10(3):182—6
8. Chaudhuri S., Wyrick J.J., Smerdon M.J. Histone H3 Lys79 methylation is required for efficient nucleotide excision repair in a silenced locus of Saccharomyces cerevisiae // 2009. Nucl. Ac. Res. V.37. p.1690—1700.
9. Cole G.M., Schild M., Lowett S.T., Mortimer R.K. Regulation of RAD54- and RAD52-lacZ gene fusions in Saccharomyces cerevisiae in response to DNA damage //  1987. Mol. Cell. Biol. V.19877. Iss.3. p.1078—1084.
10. Kats E.S., Albuquerque C.P., Zhou H., Kolodner R.D. Checkpoint functions are required for normal S-phase progression in Saccharomyces cerevisiae RCAF- and CAF-I-defective mutants // 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(10):3710—5
11. Petukhova G., van Komen S., Vergano S., Klein H., Sung P. Yeast Rad54 promotes Rad51-dependent homologous DNA pairing via ATP hydrolysis-driven change in DNA double helix conformation // 1999. J. Biol. Chem. 274(41):29453—62
12. Roman H. A system selective for mutations affecting the synthesis of adenine in yeast // 1956. Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. Ser. Physiol. V.26. p.299—314.
13. vanLeeuwen F., Gafken P.R., Gottschling D.E. Dot1p modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core // 2002. Cell. V.109. p.745—756.
14. Yamaki M., Umehara T., Chimura T., Horikoshi M. Cell death with predominant apoptotic features in Saccharomyces cerevisiae mediated by deletion of the histone chaperone ASF1 // 2001. Genes Cells 6(12):1043—54.

Literature

1. Zaxarov I.A., Kozhin S.A., Kozhina T.N., Fedorova I.V. Sbornik metodik po genetike drozhzhej-saxaromicetov // L. Nauka. 1984. 144 s.
2. Koval'cova S.V., Korolev V.G. Shtamm drozhzhej Saccharomyces cerevisiae dlya testirovaniya mutagenov okruzhayushhej sredy, osnovannyj na vzaimodejstvii mutacij rad2 i him1 // 1996. Genetika. T.32(3). s.366—372.
3. Fedorov D.V., Koval'cova S.V., Evstyuxina T.A., Peshexonov V.T., Chernenkov A.Yu., Korolev V.G. // Gen HSM6 identichen genu PSY4 drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2013. Genetika. T.49(3). s.328—336.
4. Chernenkov A.Yu., Gracheva L.M., Evstyuxina T.A., Koval'cova S.V., Peshexonov V.T., Fedorova I.V.,  Korolev V.G. // Vzaimodejstvie gena HSM3 s genami e'pistaticheskoj gruppy RAD6 u drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2012. Genetika. T.48(2). s.160—167.
5. Chernenkov A.Yu., Fedorov D.V., Gracheva L.M., Evstyuxina T.A., Koval'cova S.V., Peshexonov V.T., Fedorova I.V., Korolyov V.G. // Vzaimodejstvie gena HSM3 s genami, iniciiruyushhimi gomologichnuyu rekombinacionnuyu reparaciyu u drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2012. Genetika. T.48(3). s. 333—339.
6. Chernenkov A.Yu., Fedorov D.V., Kosareva A.A., Kozhina T.N., Korolev V.G. // Izmenenie chastot spontannogo mutageneza pri kombinaciyax mutacij hsm3 i hsm6 s mutaciejrad52 v kletkax drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2014. Genetika. T.50(2). s.243—245.