Вступление
Ротавирусы, представители одноимённого рода семейства Reoviridae были открыты уже более 60 лет назад, однако, вызываемые ими гастроэнтериты остаются актуальными до сих пор. Согласно классификации, ротавирусы разделены на 7 групп - А, В, С, Д, Е, F, и G, антигенно не связанных друг с другом. При этом, заболевания у людей и животных могут вызывать представители первых трёх групп, а остальные обнаруживаются только у животных.
Геном всех вирусов этого семейства представлен уникальной двунитчатой сегментированной РНК, разделяющейся при электрофорезе (ЭФ) на сегменты, причём у реовирусов их 10, а у ротавирусов-11 [7]. Ещё одной важной и уникальной особенностью ротавирусов, в отличие от всех остальных представителей семейства, является их потребность в трипсине, без которого воспроизводство вирусного потомства невозможно [4].
Ротавирусы группы А (рис. 1), возбудители вирусной инфекции с ярко выражен-ной сезонностью (ноябрь-март), играют ведущую роль в кишечной патологии, особенно у детей до 2-х лет, являясь причиной возникновения от 45 до 50% всех ГЭ инфекционной природы [1-6].
Рисунок 1. Электронномикроскопическая фотография: ротавирусы человека группы А. Негативное контрастирование. Ув. 200 000. Препарат Колпакова С. А.
Ротавирусы групп В и С выглядят на этом фоне значительно скромнее - на их долю приходится от 3-х до 8% вирусных ГЭ [8].
Целью настоящей работы была адаптация ротавирусов человека к росту в перевиваемой культуре клеток для создания на их основе диагностических тест-систем, а также для изучения возможности применения адаптированных штаммов ротавируса человека в качестве вакцинных.
Материалы и методы
Культуры клеток. В работе использовали культуру перевиваемых клеток эмбриона свиньи (СПЭВ), культивируемую на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС).
Вирусы. Фекальные 10 % суспензии готовили по обычной методике. Перед заражением клетки три раза промывали раствором Хенкса и наслаивали предварительно обработанные 0,25% раствором трипсина суспензии фекалий больных детей, в которых методом электронной микроскопии (ЭМ) были обнаружены ротавирусы. После контакта восстанавливали первоначальный объём питательной средой без сыворотки и оставляли в термостате при 37 ° С.
Каждый пассаж контролировали на наличие ротавируса методом ЭМ на микроскопе УМВ-100К при инструментальном увеличении 65000-85000.
Выделение РНК. РНК ротавирусов и реовирусов выделяли, как описано в [3] с незначительными авторскими модификациями.
Электрофорез. Вертикальный электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) (ph-8,8) с концентрирующим 4% гелем (ph-5,8) при токе 8-15 мА в течение 15-24 часов.
Диагностикумы. Для детекции ротавирусов группы А, кроме ЭМ, использовали разработанный нами ранее антительный эритроцитарный диагностикум «Ротатест» для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) [1-2].
Диагностикум представляет собой 1% взвесь фиксированных эритроцитов барана, сенсибилизированных γ- глобулиновой фракцией асцитной жидкости белых крыс, иммунизированных ротавирусом обезьян SA-11.
Диагностикум «Ротатест-К» получен по указанной выше технологии, но для иммунизации крыс брали соответственно ротавирусы группы К.
Животные. Использовали белых беспородных крыс весом 120-150 гр. Для получения штаммоспецифических антител каждую группу крыс иммунизировали «своим» штаммом ротавируса. После 8-ой иммунизации животным вводили в брюшную полость опухоль яичника крыс (штамм ОЯ) и через 10-15 дней собирали иммунное сырьё в виде иммунной асцитной жидкости.
Результаты
Для адаптации ротавирусов мы отбирали пробы, в которых по данным ЭМ количество двухкапсидных вирионов ротавируса было максимально, так как наличие внешнего капсида связано с инфекционностью - способностью вируса заражать живую клетку. Принадлежность этих ротавирусов к группе А была подтверждена в РНГА с ''Ротатестом''. Потребовалось несколько ''слепых'' пассажей, прежде чем все взятые в работу штаммы ротавируса стали демонстрировать характерные признаки повреждения клеток. Начиная с 4-ого пассажа, через 48 часов наступала полная деструкция монослоя клеток. С каждым последующим заражением количество ротавируса нарастало и через некоторое время, нам удалось довести его урожай на уровне 10-16 пассажа до 1·109 - 6·109 вирионов в 1 мл культуральной жидкости.
Всего было адаптировано 18 штаммов ротавируса, которые при ЭМ имели типичную для ротавирусов всех групп морфологию и не размножались без предварительной обработки трипсином (рис. 2).
Рисунок 2. Электронномикроскопическая фотография: культуральные рота-вирусы человека группы К (РВК). Негативное контрастирование. Ув. 200 000. Препарат Колпакова С. А.
А поскольку в работу были взяты пробы фекалий, положительные в РНГА с «Ротатестом» на ротавирус группы А, мы нисколько и не сомневались в принадлежности к этой же группе адаптированных нами штаммов и других методов контроля не применяли.
Неожиданности начались после того, как мы решили дать количественную характеристику (титры) культуральных штаммов ротавируса человека в РНГА.
Ни один из адаптированных штаммов ротавируса не реагировал с «Ротатестом»', что сначала показалось нам совершенно невозможным, так как диагностикум прекрасно «работал» с антигеном ротавируса обезьян SA-11, выявляя его в разведении 1:4000. Однако, наличие в этих пробах большого количества ротавирусов при ЭМ, могло говорить только о том, что выращенные нами на культуре клеток вирусы, не относятся к ротавирусам группы А.
Принадлежность к одной из остальных групп можно было бы установить в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток с помощью антисывороток, но из-за их отсутствия это пока невозможно. Оставался ещё один путь - электрофорез в ПААГ ротавирусной РНК, позволяющий по геному оценить принадлежность изучаемого штамма к той или иной антигенной группе.
Первый же ЭФ РНК наших ротавирусов показал, что их электрофоретип нельзя отнести ни к одной из известных на сегодняшний день группе ротавирусов. Для удобства обозначения авторы предлагают для них рабочее название - ротавирусы группы К (РВК). На рис.3а представлен ЭФ РНК 3-х культуральных штаммов РВК (треки №2-4) и 4-х штаммов ротавируса группы А различных электрофоретипов (треки №5-8), выделенных от больных ротавирусными ГЭ, причём в пробе №5 обнаружены ротавирусы сразу 2-х форетипов. Здесь и далее в скобках представлены номера анализов по рабочему журналу.
Гены РВК оказались в 1,5-2 раза тяжелее генов ротавируса группы А, а по характеру распределения сегментов похожи на ЭФ РНК реовируса (рис.3а, трек №1).
Рисунок 3. Электрофореграммы РНК: а - 1- культурального реовируса чело-века; 2-4- культуральных ротавирусов группы К; 5- 8-ротавирусов человека группы А (5-№833, 6-№834, 7- №844, 8- №818). I- 10,0 mA, h-16 час. б- треки 1-7 как на ''а''; 8-10- ротавирусов группы А (5- №833, 6- №837, 7- №818). I- 11,0 mA, h-20 час. ''а'' и ''б'' - ПААГ- 8%. Препарат Колпакова С. А.
Однако, если ток и время проведения ЭФ увеличить, становятся видны и существенные различия (рис.3б, треки №1и №2-4). Количество генов, визуально определяемых у РВК равно 10, но на каждой из почти 100 форерамм, сделанных нами, 6-ой сегмент от начала старта всегда окрашивался в 1,5-2 раза интенсивнее, чем 4-ый и 5-ый, что может говорить о том, что генов всё же 11.
Интересные результаты получены при ЭФ проб, в которых одновременно находятся ротавирусы группы А и РВК: на рис. №4 (трек б) видно, что 6-ой ген ротавируса группы А всегда идёт слитно с 8-ым геном РВК.
Рисунок 4. Электрофореграмма РНК: а -только РВК (№822), б - РВК вместе с ротавирусами группы А (№844); в -только ротавирусы группы А (№818). Первая колонка цифр показывает номера генов РВК, а вторая - номера генов ротавирусов группы А. I- 11,2 mA, h-18 час. ПААГ- 8%. Препарат Колпакова С. А.
Это говорит о том, что молекулярные массы этих генов одинаковы. А поскольку известно, что именно продукты 6-ого (капсомеры внутреннего капсида) гена ротавируса группы А ответственны за внешний вид вириона при ЭМ, то это и объясняет с одной стороны идентичность внешнего вида вирусов с таким непохожим профилем распределения РНК, а с другой стороны позволяет с достаточной долей вероятности предположить, что продуктами 8-ого гена РВК являются белки внутреннего капсида (групповая специфичность).
В качестве реовирусного стандарта мы использовали РНК культурального реовируса человека, выделенного от больного гепатитом и адаптированного к росту в культуре клеток СПЭВ. На основе этого вируса, нами был создан антительный эритроцитарный диагностикум ''Реотест'' для РНГА, выявляющий все 3 серотипа реовируса, поскольку известно, что они имеют общий группоспецифический антиген. Проверка в РНГА с «Реотестом» всех 9 штаммов РВК, взятых в работу, как и ожидалось, несмотря на большое количество вирусных частиц -6·109 в 1мл культуральной жидкости, показала отрицательный результат. Таким образом, ещё одним методом подтверждена уникальность и самостоятельность новой группы ротавирусов. Именно группы, так как в перекрёстной РН на культуре клеток с моновалентными антисыворотками к каждому штамму ротавируса было определено не менее трёх серотипов РВК. При этом все выделенные ротавирусы имели общий группоспецифический антиген, так как агглютинация с каждым штаммом РВК сенсибилизированных эритроцитов нового диагностикума, о котором сказано ниже, в равной мере подавлялась гомологичными и гетерологичными антителами.
Для изучения роли РВК в детской кишечной патологии был создан с использова-нием смеси антисывороток ко всем штаммам РВК поливалентный диагностикум, получивший рабочее название «Ротатест- К».
Диагностикум показал 100% специфичность, реагируя в высоких титрах только с РВК и не реагируя с ротавирусами группы А, реовирусами, аденовирусами и энтеровирусами. С его помощью исследовали в РНГА 235 фекальных суспензий от детей, больных инфекционными ГЭ. Одновременно в этих же суспензиях искали с помощью ''Ротатеста'' ротавирусы группы А.
Полученные результаты оказались чрезвычайно неожиданными и интересными.
Более 75% проб оказались положительными на РВК, причём в 50 % из них выявлялись также и ротавирусы группы А. Реакция на РВК во всех случаях была специфичной, так как агглютинация эритроцитов подавлялась антителами против РВК. Наличие ротавирусов в пробах во всех случаях было подтверждено методом ЭМ.
В отличие от ротавирусов группы А, частота выделения РВК от больных инфекционными ГЭ не связана с сезонностью и в процентном отношении равномерно распределена в течение всего года.
Обсуждение
Проведённая работа позволила не только выделить и адаптировать к росту в перевиваемой культуре клеток неизвестную ранее группу ротавирусов человека, но и показать их чрезвычайно высокую распространённость у детей до 2-х лет жизни с кишечной патологией. Применение нового эритроцитарного диагностикума при обследовании детей, больных инфекционными Г Э, выявило у 75 % всех обследованных ротавирусы новой группы, что в 100% случаев было подтверждено методами прямой просвечивающей ЭМ и ЭФ РНК РВК, выделенных из фекальных суспензий больных.
Полученные предварительные результаты, на наш взгляд, чрезвычайно интересны и требуют дополнительных исследований в этом направлении.
Список литературы
- Дроздов С. Г. и др. Ротавирусная инфекция. М.1989, 32 с.
- Колпаков С. А. Автореф. дис. …кан-та мед. наук. - М.,1990. 141 с.
- Новикова Н. А., Анцупова А. С. // Вопр. вирусол. 1987. № 2. С. 238-241.
- Almeida, J. D. // J. Gen. Virol. 1978. 40, 213-219.
- Brandt, C. D. et al. // J.Сlin. Microbiol. 1983. 18, 71-78.
- Davidson, G. P., et al. // Lancet 1975. i: 242-245.
- Kalica, A. R. et al. // Virology1978. 87, 247-255.
- Geyer, A., et al. //. J.S.Afr. Vet. Assoc. 1996. 67 (3), 115-116.
Spisok literature
- Drozdov S. G. i dr. Rotavirusnaya infekciya. M.1989, 32 p.
- Kolpakov S. A. Avtoref. dis. …kan-ta med. nauk. - M.,1990. 141 p.
- Novikova N. A., Ancupova A. S. // Vopr. virusol. 1987. № 2. P. 238-241.
- Almeida, J. D. // J. Gen. Virol. 1978. 40, 213-219.
- Brandt, C. D. et al. // J.Slin. Microbiol. 1983. 18, 71-78.
- Davidson, G. P., et al. // Lancet 1975. i: 242-245.
- Kalica, A. R. et al. // Virology1978. 87, 247-255.
- Geyer, A., et al. //. J.S.Afr. Vet. Assoc. 1996. 67 (3), 115-116.