Роль полиморфизма генов микроРНК и фолатного цикла в невынашивании беременности

Введение

МикроРНК, короткие некодирующие РНК, участвуют в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов посредством комплементарного связывания с мРНК. Однонуклеотидные мутации в генах микроРНК могут изменять экспрессию и/или созревание транскриптов, а также влиять на регуляторную способность микроРНК (Li et al., 2016; Li et al., 2017). Показано, что мутации в генах микроРНК связаны с патологиями эндометрия, преэклампсией, дефектами нервной трубки, бесплодием и рецидивирующими потерями беременности (Rah et al., 2017; Shaker et al., 2019).

МикроРНК могут оказывать значительное влияние на течение беременности посредством контроля таких процессов как формирование и развитие эндометрия (микроРНК-200), клеточная дифференцировка, ангиогенез во время формирования плаценты (микроРНК-25, микроРНК-32, микроРНК-125), имплантация бластоцисты (микроРНК-605), а также участие в различных биохимических процессах в клетках, в том числе и в фолатном обмене (микроРНК 27a, микроРНК-22-3p, микроРНК-149-5p) [Li C. et al.,2017; Zhao et al., 2017; Wang, Chang, Zhang, 2020; Wang et al., 2018, 2020). МикроРНК 27a может оказывать влияние на течение беременности, принимая участие в различных биохимических процессах в клетках, в том числе, и в фолатном обмене (Wang et al., 2016; Baker et al., 2017).

Полиморфизм генов микроРНК может быть связан с нарушением экспрессии генов фолатного цикла. Статус фолатов, в свою очередь, может влиять на профили микроРНК непосредственно изменением метилирования ДНК генов, кодирующих микроРНК, либо посредством модулирования экспрессии генов восходящих сигнальных путей микроРНК из-за изменений в гомеостазе клеток. Таким образом, существуют двунаправленные ассоциации между статусом фолатов и профилями микроРНК (Beckett, Veysey, Lucock, 2017).

Целью данного исследования является выявление роли полиморфных вариантов гена miRNA27a и генов фолатного цикла в невынашивании беременности первого триместра.

Материал и методы

В работе были исследованы образцы ДНК женщин двух групп. Контрольную группу составили 48 образцов ДНК женщин, у которых не зафиксировано случаев прерывания беременности в первом триместре гестации. Группу сравнения составили образцы ДНК женщин со случаями спонтанного аборта (29 образцов) и/или неразвивающейся беременности (31 образец). Средний возраст женщин контрольной группы был 29 лет, тогда как в группе сравнения – 30 лет. Все женщины подписали информированное согласие об участии в исследовании. ДНК выделяли из клеток крови, которую забирали утром натощак из локтевой вены.

В исследуемые группы не включали женщин с гипертонией, сахарным диабетом, аутоиммунными заболеваниями и рядом других соматических патологий.

Для выделения ДНК использовали набор реагентов «ДНК-экспресс-кровь» (Литех, Россия). Аллельные варианты 677C>T (rs1801133), 1298A>C гена MTHFR, 66A>G (rs1801394) гена MTRR, 2756A>G (rs1805087) гена MTR исследовали с использованием наборов реагентов SNP-экспресс (Литех, Россия).

SNP (rs895819) гена miRNA27a исследовали путем анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Для амплификации участка гена miRNA27a использовали праймеры: прямой 5`- GAACTTAGCCACTGTGAACACCACTTGG, обратный 5`- TTGCTTCCTGTCACAAATCACATTG. Программа амплификации: 95⁰C 5 минут; 40 циклов 95⁰C 25 сек, 60⁰C 30 сек, 72⁰C 30 сек.; заключительная элонгация 72⁰C 5 минут.

После амплификации проводили рестрикционный анализ полученного продукта длиной 182 п.н. с использованием рестриктазы DraIII. После рестрикции возможно получение следующих продуктов: один фрагмент длиной 182 п.н. – характерен для генотипа GG, два продукта длиной 155 и 27 п.н. – характерны для генотипа АА и три фрагмента длиной 182, 155 и 27 п.н. – характерны для генотипа АG (Cao et al., 2014) (рис. 1). Детекцию продуктов ПЦР и рестрикции проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле.

Рисунок 1 – Результат электрофоретического разделения продуктов рестрикции для гена miRNA27a (rs895819). Цифрами обозначены лунки: нечетными – ПЦР-продукты, четными – продукты после рестрикции; М – маркер (слева направо: 766; 500; 300; 150; 50; п.н.); в лунках 2 и 8 (часть А) и 4 и 9 (часть В) – выявлены фрагменты ДНК размером 182 и 155 п.н (генотип AG). В лунках 4,7,9 (часть А) и в лунке 6 (часть В) выявлены фрагменты ДНК размером 182 п.н. (генотип GG). В лунке 6 (часть А) и в лунках 2 и 8 (часть В) выявлены фрагменты ДНК размером 155 п.н (генотип AA).

Определение концентрации гомоцистеина проводили иммуноферментным методом с использованием реагентов «AxisHomocysteineEIA» (производство «Axis-Shield», Норвегия).

Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли с использованием Hardy-Weinberg equilibrium calculator в программе https://wpcalc.com/en/equilibrium-hardy-weinberg. Оценку различий в распределении аллельных вариантов генов в обследованных группах осуществляли по критерию χ².

Анализ гаплотипов проводили в программе «Haploview» (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads).

Оценку роли взаимодействий между исследуемыми генетическими локусами проводили с использованием программы Multifactor Dimensionality Reduction (MDR).

Коэффициент ранговой корреляции Спирмена рассчитывали в программе «GraphPad InStat».

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты анализа частот аллелей по полиморфизму 677C>T, 1298A>C гена MTHFR, 66A>G гена MTRR, 2756A>G гена MTR свидетельствуют об отсутствии ассоциации данных однонуклеотидных замен с риском невынашивания беременности в первом триместре (табл. 1). Частоты генотипов по исследуемым SNP генов соответствуют равновесию Харди-Вайнберга в обеих группах женщин.

Таблица 1 – Частоты аллелей по SNP генов фолатного цикла в группе женщин с невынашиванием беременности и контрольной группы

Частота встречаемости гаплотипов для гена MTHFR в исследуемых нами группах женщин представлена в таблице 2. Гаплотип TA в группе женщин с невынашиванием беременности регистрируется в 1,6 раз чаще по сравнению с контролем.

Таблица 2 – Частота гаплотипов гена MTHFR в исследуемых группах женщин

Повышенной экспрессией во время беременности обладает miRNA27a. Данный ген расположен на 19 хромосоме и имеет полиморфизм rs895819 (А>G) в положении 40 относительно первого нуклеотида (Rah et al., 2017; Shaker et al., 2019). Для микроРНК-27а известна мишень в мРНК гена MTHFR – сайт связывания 7mer-8m (база данных – http://www.mirbase.org/). Результаты анализа частот генотипов и аллелей по полиморфизму гена miRNA27a (rs895819) представлены на рисунке 2. Частоты генотипов по исследуемому аллельному варианту гена miRNA27a соответствуют равновесию Харди-Вайнберга (контроль: χ2=2,37, р>0,05; группа с НБ: χ2=1,40, р>0,05).

Аллель А является преобладающей для обеих групп. Наиболее часто встречающимся генотипом для обеих групп является генотип AA. Гетерозиготы встречаются в 1,5 раза чаще в группе с невынашиванием беременности по сравнению с контрольной группой. В ходе исследования не выявлена статистически значимая разница в частотах генотипов (χ2=0,55, р= 0,76) и аллелей (χ2=0,596, р=0,28) по полиморфизму A>G гена miRNA27a (rs895819) между двумя группами обследуемых женщин.

Рисунок 2 – Частоты генотипов (%) и аллелей по полиморфизму A>G (rs895819) гена miRNA27a при невынашивании беременности и в контрольной группе

Для выявления сочетанного эффекта исследуемых SNP проводили анализ межгенных взаимодействий. Результаты представлены в таблице 3. Получена одна статистически значимая двухлокусная модель «miRNA27a A>G, MTHFR 677С>Т» с воспроизводимостью – 8/10. Распределение двухлокусных генотипов представлено на рисунке 3.

Таблица 3 – Характеристика модели межгенного взаимодействия исследуемых локусов

Рисунок 3 – Распределение частот двухлокусных сочетаний генотипов по полиморфизму генов MTHFR и miRNA27a:левые столбики в ячейках – НБ, правые столбики в ячейках – контроль;0 – гомозиготы по частому аллелю, 1- гетерозиготы, 2 – гомозиготы по редкому аллелю

Статистический анализ выявил один двухлокусный генотип, ассоциированный с понижением риска НБ (рис. 3, ячейка «а») – для гомозигот по аллелю 677С гена MTHFR и гомозигот по аллелю А гена miRNA27a. Вариант двухлокусного генотипа «а» ассоциирован со снижением риска развития невынашивания беременности (OR = 0,04 (95% CI 0,016-0,99)). Это объясняется тем, что генотип СC по полиморфизму 677C>T в гене MTHFR обеспечивает синтез в клетках функционально активной формы фермента 5,10-метилентетрагидрофолат-редуктазы. Данные литературы о роли полиморфизма A>G гена miRNA27a различны. В частности установлено, что аллель G полиморфизма rs895819 miRNA27a ассоциирована со сниженным риском развития невынашивания беременности (Rah et al., 2017). При этом показана статистически значимая связь между генотипами miRNA27a и уровнем фолиевой кислоты в плазме крови. Функциональный анализ показал, что генотипы AG и GG могут быть ответственны за повышение уровня микроРНК-27а в плазме крови, что в свою очередь ведет к повышению уровня фолиевой кислоты и является защитным механизмом от невынашивания беременности, особенно в случае наличия полиморфизма в генах фолатного цикла, ведущих к снижению концентрации либо активности таких ферментов, как MTHFR, MTRR и MTR (Rah et al., 2017). В других исследованиях была выявлена ассоциация между генотипом GG гена miRNA27a и повышенным риском развития невынашивания беременности (Wang et al., 2016).

На рисунке 4 представлено графическое изображение модели взаимодействия между пятью исследуемыми локусами. Суммарная информационная ценность индивидуальных локусов составила 8,1 %. Максимальный эффект проявляет локус MTHFR 677C>T. Это связано с его функциями: он обеспечивает превращение 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат. Однако при наличии мутантной аллели T, активность фермента в значительной мере снижается, что в свою очередь может приводить к накоплению гомоцистеина и развитию гипергомоцистеинемии.

Среди всех генов фолатного цикла взаимодействие локусов MTRR 66A>G и MTHFR 1298A>C более значимо, чем их индивидуальный эффект (показатель информационной ценности взаимодействия двух данных локусов в 5 раз выше суммы их индивидуальных эффектов) (рис. 4). Совместный эффект локусов miRNA27a и MTHFR 677C>T составляет 5,9 %, что превышает совместный эффект остальных генов фолатного цикла в сочетании с геном miRNA27a.

Рисунок 4 – Графическое изображение результатов анализа межгенных взаимодействий

Одновременное наличие в генотипе женщины полиморфных вариантов генов фолатного цикла и аллели G по гену miRNA27a (rs895819) может приводить к снижению экспрессии генов фолатного цикла, уменьшению активности и уровня ферментов и, вследствие этого, накоплению гомоцистеина и развитию гипергомоцистеинемии, что в свою очередь оказывает негативное влияния на течение и результаты беременности (Wang et al., 2016).

Далее для 48 образцов сыворотки женщин нами был проведен анализ уровня гомоцистеина. С использованием корреляционного анализа по методу Спирмена была обнаружена взаимосвязь между уровнем гомоцистеина и генотипом женщины по полиморфизму 66A>G гена MTRR (r=0.38; p=0,007). У женщин с генотипом GG уровень гомоцистеина выше по сравнению с теми, кто является гомозиготой по аллели 66А. Это согласуется с данными литературы и объясняется тем, что аллель 66G гена MTRR кодирует форму фермента со снижением активности до 30% от исходного. Функция фермента MTRR связана с активацией путем реметилирования метионинсинтазы. Именно метионинсинтаза катализирует реметилирование гомоцистеина в метионин. Поэтому снижение активности фермента MTRR приводит к повышению уровня гомоцистеина (Barbosa et al., 2008).

Согласно результатам анализа межгенного взаимодействия было установлено сочетание генотипов со сниженным риском невынашивания беременности (MTHFR 677CC и miRNA-27a AA). Далее мы провели анализ уровня гомоцистеина с учетом наличия или отсутствия данного генотипа (табл. 4)

Таблица 4 – Уровень гомоцистеина в зависимости от генотипа по двум локусам (MTHFR 677CC и miRNA27a AA)

Примечание: р – сравнение между общей группой НБ и подгруппой женщин с НБ с генотипом MTHFR CC \ miRNA AA

При сравнении уровня гомоцистеина у женщин контрольной группы с генотипом CC для гена MTHFR 677C>T и AA для гена miRNA-27a с общим контролем не выявлено статистически значимой разницы в концентрации гомоцистеина. Но при сравнении группы женщин с невынашиванием беременности с генотипом CC для гена MTHFR 677C>T и AA для гена miRNA-27a A>G и общей группы женщин с группы с НБ было показано, что женщины с выявленным «защитным» генотипом имеют сниженный уровень гомоцистеина.

Заключение

Особенности генотипа женщины по полиморфным локусам генов фолатного цикла и микроРНК могут влиять на риск невынашивания беременности первого триместра.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания в сфере научной деятельности № FENW-2023-0018

Список литературы

1. Baker B. C. et al. Placental dysfunction is associated with altered microRNA expression in pregnant women with low folate status //Molecular nutrition & food research. – 2017. – Т. 61. – №. 8. – С. 1600646.
2. Barbosa P. R. et al. Association between decreased vitamin levels and MTHFR, MTR and MTRR gene polymorphisms as determinants for elevated total homocysteine concentrations in pregnant women //European journal of clinical nutrition. – 2008. – Т. 62. – №. 8. – С. 1010-1021.
3. Beckett E. L., Veysey M., Lucock M. Folate and microRNA: bidirectional interactions //ClinicaChimicaActa. – 2017. – Т. 474. – С. 60-66.
4. Li C. et al. Response of MiRNA-22-3p and MiRNA-149-5p to folate deficiency and the differential regulation of MTHFR expression in normal and cancerous human hepatocytes //PloS one. – 2017. – Т. 12. – №. 1. – С. e0168049.
5. Li Y. et al. A SNP in pri-miR-10a is associated with recurrent spontaneous abortion in a Han-Chinese population //Oncotarget. – 2016. – Т. 7. – №. 7. – С. 8208.
6. Rah H. C. et al. miR-27a and miR-449b polymorphisms associated with a risk of idiopathic recurrent pregnancy loss //PloS one. – 2017. – Т. 12. – №. 5. – С. e0177160.
7. Shaker M. et al. Association of miRNA-27a and leptin polymorphisms with recurrent pregnancy loss in Egyptian women //Meta Gene. – 2019. – С. 100617.
8. Wang C. Y. et al. Effect of miRNA-27a and leptin polymorphisms on risk of recurrent spontaneous abortion //Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research. – 2016. – Т. 22. – С. 3514.
9. Wang L., Chang S. Y., Zhang T. MiR-324–5p Regulation in Disturbed Embryogenesis Induced by Folate Deficiency //Current Developments in Nutrition. – 2020. – Т. 4. – №. Supplement_2. – С. 1279-1279.
10. Wang X. et al. The polymorphism of rs11614913 T/T in pri-miR-196a-2 alters the miRNA expression and associates with recurrent spontaneous abortion in a Han-Chinese population //American Journal of Translational Research. – 2020. – Т. 12. – №. 5. – С. 1928.
11. Wang X. Q. et al. Haplotype‐based association of two SNPs in miR‐323b with unexplained recurrent spontaneous abortion in a Chinese Han population //Journal of cellular physiology. – 2018. – Т. 233. – №. 8. – С. 6001-6017.
12. Zhao W. et al. Novel mechanism of miRNA‐365‐regulated trophoblast apoptosis in recurrent miscarriage//Journal of cellular and molecular medicine. – 2017. – Т. 21. – №. 10. – С. 2412-2425.