Введение
Определение
оптимальной иммунизирующей дозы ассоциированной вакцины, сконструированной на
основе антигенов аденовируса
В последние годы стало очевидным, что вирусные
Среди большого числа вирусов, участвующих в этиопатогенезе респираторных заболеваний телят, протекающие преимущественно в виде смешанной инфекции, важное значение имеют и аденовирусы, разделенные на 2 подгруппы на основании культуральных свойств, антигенных различий и характера вызываемых ими цитоморфологических изменений, появляющихся в процессе репродукции в чувствительной биологической системе [15].
Серологические
исследования показали, что аденовирусная инфекция крупного рогатого скота (КРС)
широко распространена во всем мире, в том числе и РФ [1]; [12]. У телят она
проявляется в виде энзоотических вспышек с массовыми пневмониями, а среди телят
Кроме
тех двух серотипов (1 и 2 серотипы) аденовируса КРС (соответственно штаммы
Для специфической профилактики аденовирусной инфекции в мировой практике используют моно-, би- и поливалентные вакцины, отличающиеся по набору аденовирусных компонентов, сочетанию их с другими возбудителями, методом изготовления и по эффективности их применения [9]; [13].
В
последующие годы и в нашей стране были изготовлены и испытаны экспериментальные
образцы моновакцины против аденовирусной инфекции КРС [4], бивалентной вакцины,
содержащие антигены аденовируса и вируса
Однако,
несмотря на значительную роль аденовирусной инфекции в этиологической структуре
На
основе результатов
Общеизвестно, что эффективность вакцины зависит от антигенной активности производственных штаммов возбудителей, выбора их типов и чувствительной системы для их репродукции, степени очистки и концентрации антигенов, входящих в состав биопрепарата, метода инактивации и оптимального соотношения адъюванта, стимулирующего процессы иммуногенеза. Кроме того, биологическая активность препарата определяется по уровню поствакцинальных антител и количеством специфического белка — иммуногенного антигена, являющегося одновременно единицей стандартизации, от которого зависит величина прививочной дозы.
Цель исследования
В этой связи, целью наших исследований явилось определение оптимальной иммунизирующей дозы предложенной нами ассоциированной вакцины, обеспечивающей максимальное стимулирование иммунологической перестройки организма у привитых животных.
Материалы и методы
Для
проведения сравнительных испытаний различных доз биопрепарата были изготовлены
экспериментальные серии ассоциированной вакцины, используя аденовирусы КРС первой
и второй подгрупп, соответственно, штамы «Adeno
III
Репродукцию
аденовируса третьей серогруппы осуществляли в перевиваемой культуре клеток
почки эмбриона коров (линия «МДВК»), а аденовируса четвертой серогруппы — в перевиваемой
культуре клеток почки теленка (линия
Для оценки безвредности использовали белых мышей (n=10) и телят (n=6) соответственно на каждую серию вакцины. Лабораторные опыты по оценки антигенной активности образцов ассоциированной вакцины проводили на кроликах живой массой 2,5–3 кг (n=3). Препарат вводили внутримышечно, двукратно с интервалом 21 день, в дозах по 1 см3 и 2 см3 соответственно, с последующим исследованием сыворотки крови, полученной через 21–30 суток после каждой вакцинации на наличие специфических антител в РМН, ИФА и РТГА.
Определение
прививочной дозы экспериментальных серий ассоциированной вакцины проводилось в производственных условиях на крупном рогатом скоте в
В
период вакцинации за животными вели клиническое наблюдение. На месте введения
вакцины наблюдалось небольшое уплотнение, которое самопроизвольно исчезало через
2–3 недели.
С
целью определения динамики нарастания титров специфических антител проводили
взятие крови у животных всех групп до вакцинации, после первой и второй
вакцинаций. Пробы сыворотки крови исследовали на наличие антител, используя
соответствующие диагностические
В каждую лунку с сывороткой вносили в равных объемах (по 50 мкл) 100ТЦД50/0,1 см3 вируса и инкубировали в течение 1 часа при 37оС. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл соответствующих суспензий культур клеток в оптимальной концентрации. Планшеты инкубировали в СО2 инкубаторе марки «Sanyo» (Япония) при 37оС в присутствии 5% СО2.
Реакцию
учитывали по мере развития цитопатического действия вируса (ЦПД) в контрольных
лунках с зараженной культурой рабочей дозой вирусов без сыворотки крови от
исследуемых животных. Учет результатов РМН проводили на инвертированном
микроскопе марки «Nikon eclipse TS 100» (Япония)
спустя 48 часов для герпесвируса типа I, а планшеты с аденовирусами
Максимальное разведение сыворотки, полностью нейтрализующее ЦПД вируса в 50% инфицированных лунок, принимали за титр сыворотки.
В реакции использовали контроли: гипериммунную моноспецифическую сыворотку кролика, полученную к каждому штамму вирусов; в качестве отрицательного контроля — сыворотку крови КРС, не содержащую специфических антител к вирусам, используемым в опыте.
Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2010.
Результаты и обсуждение
В опытах установили, что экспериментальные образцы вакцины стерильны, безвредны для лабораторных и естественно восприимчивых животных, вызывают у кроликов формирование выраженного иммунного ответа ко всем антигенным компонентам (таблица 1).
Таблица 1 — Показатели антигенной активности ассоциированной вакцины на кроликах. (M±m, n=3, р<0,05)
|
Титр антител * |
||||
АВIII |
АВIV |
ИРТ |
|
|
|
ИФА |
1866,67±92,25 |
2133,33±246,23 |
2400,00±286,19 |
2666,67±266,46 |
213,33±58,36 |
РМН |
61,33±3,01 |
53,33±7,23 |
29,33±3,01 |
40,89±7,23 |
Примечание: * — приведена обратная величина среднеарифметического значения титров антител по группе животных
Перед
проведением опытов был изучен иммунологический статус подопытных животных.
Уровень антител к аденовирусам, герпесвирусу типа I,
вирусам
В пробах крови всех возрастных групп животных после первой вакцинации отмечали достоверное повышение титра антител ко всем вирусным антигенным компонентам вакцины, в сравнении с исходным (Р<0,05). Максимальный уровень антител у всех групп животных выявляли через 30 суток после второго введения вакцины. Статистически обработанные показатели формирования специфических антител подопытных животных представлены в таблицах 2 и 3.
Из
представленных данных в таблице 2 следует, что наибольший титр антител в ИФА и
антигемагглютинины в РТГА к вирусу
В результате проведенных исследований определена оптимальная прививочная доза ассоциированной вакцины, которая для глубокостельных коров, нетелей и молодняка 4–6 месячного возраста и старше составила 2 см3, для телят 25–30 суточного возраста — 1 см3.
Таблица 2 — Уровень гуморальных антител в
сыворотке крови крупного рогатого скота после II
вакцинации разными дозами ассоциированной вакцины против аденовирусной,
герпесвирусной инфекции типа I,
Возрастная группа |
Доза, см3 |
Титр антител * |
||||
(ИФА) |
(ИФА) |
ИРТ (ИФА) |
(РТГА) |
(ИФА) |
||
глубокостельные коровы и нетели |
1 |
2240,00±657,27 |
2080,00±536,66 |
2400,00±565,69 |
320,00±97,98 |
1920,00±606,63 |
2 |
2400,00±565,69 |
2880,00±357,77 |
2560,00±438,18 |
512,00±87,64 |
2240,00±438,18 |
|
3 |
2560,00±438,18 |
3200,00±0,00 |
2560,00±438,18 |
768,00±141,11 |
2400,00±565,69 |
|
телята 25–30 — дневного возраста |
0,5 |
1920,00±357,77 |
1920,00±357,77 |
1200,00±282,84 |
68,00±27,93 |
960,00±178,89 |
1 |
2080,00±536,66 |
2240,00±438,18 |
1600,00±0,00 |
164,00±53,10 |
1440,00±178,89 |
|
2 |
2560,00±438,18 |
2240,00±438,18 |
1920,00±357,77 |
192,00±60,66 |
1840,00±657,27 |
|
молодняк старше 6 месяцев |
1 |
2240,00±438,18 |
1440,00±178,89 |
1360,00±558,57 |
320±0,00 |
1760,00±438,18 |
2 |
2560,00±438,18 |
2560,00±438,18 |
2560,00±438,18 |
384,00±71,55 |
2880,00±357,77 |
|
3 |
2880,00±357,77 |
2880,00±357,77 |
2560,00±438,18 |
448,00±87,64 |
2880,00±357,77 |
Примечание: * — приведена обратная величина среднеарифметического значения титров антител по группе животных
Таблица 3 — Уровень вируснейтрализующих антител
в сыворотке крови крупного рогатого скота после II
вакцинации разными дозами ассоциированной вакцины против аденовирусной,
герпесвирусной инфекции типа I,
Возрастная группа |
Доза, см3 |
Титр антител * |
||||
(РМН) |
(РМН) |
ИРТ (РМН) |
(РТГА) |
(РМН) |
||
глубокостельные коровы и нетели |
1 |
33,60±2,13 |
33,60±3,13 |
53,76±3,11 |
487,27±52,20 |
31,36±0,65 |
2 |
56,00±7,85 |
60,00±7,71 |
54,40±8,20 |
552,00±55,19 |
54,40±9,63 |
|
3 |
56,17±7,94 |
61,00±8,23 |
55,70±8,20 |
574,30±52,20 |
56,20±9,72 |
|
телята 25–30 — дневного возраста |
0,5 |
52,00±6,21 |
54,17±9,00 |
43,81±6,08 |
150,00±50,12 |
45,00±4,32 |
1 |
57,26±8,46 |
56,00±9,11 |
49,60±7,23 |
158,00±58,36 |
51,20±5,53 |
|
2 |
62,30±7,35 |
63,46±8,75 |
57,11±7,15 |
163,00±58,20 |
53,40±5,40 |
|
молодняк старше 6 месяцев |
1 |
52,50±3,21 |
47,17±4,50 |
53,70±1,18 |
321,12±64,30 |
35,40±4,98 |
2 |
57,60±4,50 |
54,40±5,15 |
60,80±3,37 |
436,00±77,10 |
41,60±6,75 |
|
3 |
61,40±5,20 |
61,40±5,20 |
72,21±3,70 |
527,15±63,20 |
44,70±5,20 |
Примечание: * — приведена обратная величина среднеарифметического значения титров антител по группе животных
Испытание ассоциированной вакцины в лабораторных и производственных условиях показало, что она безвредна, ареактогенна и вызывает, в установленных нами дозах, формирование напряженного иммунного ответа у животных на тридцатые сутки после двукратного введения.
Одним
из основных преимуществ предложенной ассоциированной вакцины является включение
в ее состав антигенных компонентов аденовирусов КРС
Изучая
причины вспышек респираторных заболеваний телят еще в
Обращает
на себя внимание высказывание ряда ученых о том, что достижения в иммунопрофилактике аденовирусной инфекции более скромны, чем при других
вирусных заболеваниях телят
При сравнительном изучении серотипов аденовируса первой подгруппы (1, 2, 3, 9, 10 серотипы) было доказано, что серотип три наиболее патогенен для новорожденных телят: симптомы поражения органов дыхания и энтерита наблюдали как в естественных условиях, так и на опытах по воспроизведению экспериментальной инфекции [14].
Способность аденовирусов КРС различных серотипов обусловливать респираторные заболевания у молодых телят показана и другими исследователями. По мнению Gillespie J. (1973) [11] вирусы третьего и четвертого серотипов вызывают более тяжелые заболевания у телят, чем вирусы первого и второго типов, которые оказывают легкую реакцию или вовсе ее не вызывают у телят, лишенных молозива или выкормленных на обычном рационе.
Для
профилактики аденовирусной инфекции в Австрии применяют инактивированную
вакцину, изготовленную на основе четвертого серотипа антигена аденовируса
второй подгруппы. По мнению Bürki F. et
al. (1973) [9] вакцинация сопровождалась четкой
сероконверсией и защитой животных от заражения гомологичным вирусом. Причем, в сравнительных опытах была установлена более высокая иммуногенность ее с адъювантом,
состоящим из
В работах ряда авторов также была показана перспективность и целесообразность
создания ассоциированных вакцин с обязательным включением в их состав антигенов
аденовирусов КРС
В процессе проведения производственных испытаний было установлено, что предложенная
нами ассоциированная вакцина является безопасным, высокоэффективным
биопрепаратом. Мы считаем, что широкое внедрение ее в ветеринарную практику
обеспечит защиту молодняка КРС от основных вирусных
Выводы
Конструирование
новой «Ассоциированной вакцины против
аденовирусной, герпесвирусной инфекции типа I,
Экспериментальные серии ассоциированных вакцин, изготовленные для проведения сравнительных испытаний различных доз биопрепарата, безвредны, стерильны, обладают антигенной активностью и индуцируют формирование гуморального иммунного ответа у кроликов. В производственных условиях определены прививочные дозы для различных возрастных групп КРС, которые при соблюдении технологических требований по изготовлению и биологического контроля вакцины, обеспечивают напряженный иммунный ответ после двукратной иммунизации животных.
Литература
- Белоусова,
Р. В. Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота /Р. В. Белоусова // Ветеринария. — 1989. — № 9. — С. 2–25. - Гаффаров,
Х. З. Ретроспективный анализреспираторно-кишечных вирусов, циркулирующих среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья./Х. З. Гаффаров ,М. А. Ефимова ,Л. Ш. Дуплева и др // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.Н. Э. Баумана . — Казань. — 2013. — Т.216. — стр. 78–84. - Гуненков,
В. В. Малоизвестные вирусные инфекции крупного рогатого скота / В. В. уненков,В. Н. Сюрин ,К. К. Вертинская //. — М.: МВА. — 1972. — 1–36 с. - Литвинов,
О. Б. Антигенные и иммуногенные свойства инактивированной аденовирусной вакцины /О. Б. Литвинов ,Р. В. Белоусова ,В. Н. Сюрин и др. // — Труды ВИЭВ: Проблемы ветеринарной иммунологии. — 1983. — т. 57. — С. 116–119. - Сюрин,
В. Н. Вирусные болезни животных: аденовирусная инфекция крупного рогатого скота //В. Н. Сюрин ,А. Я. Самуйленко . — Москва. — ВНИТИБП. — 1998. — с.795–801. - Шемелькова,
Г. О. Специфическая профилактика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с использованием комбинированной вакцины /Г. О. Шемелькова ,А. Е. Верховская ,Г. Л. Соболева и др. // Ветеринария Кубани. — 2013. — № 3. — С. 1/7 — 7/7. - Babiuk, L. A.
et al., Nucleotide sequence genome organization and transcription map of bovine
adenovirus type 3./
L. A. Babiuk et al. // J. Virol. — 1998. — 72:1394–1402. - Benkö, M.
Family Adenoviridae, virus taxonomy: 8th report of the international
committee on taxonomy of viruses. / M. Benkö, B. Harrach,
G. W. Both et al. // Academic Press, San Diego. — 2005. — p.213–228. - Bürki, F.
Experimental Adenovirus Vaccines in Cattle. / F. Bürki // J. Amer. Vet.
Med. Assoc. — 1973. —
v. 163. — № 7. — p.897–900. - Darbishire, J. H.,
Dawson
P. S. , Lamont P.H. et al., — A new adenovirus serotype of bovine origin. J.Comp. Pathol. — 1965 — 75: 327–330 - Gillespie, J. J Amer. Vet. Med. Assn. — 1973. — 163. — № 7. — 901
- Lehmkuhl, H. D., Habbs L. A. — Serologic and hexon phylogenetic analysis of ruminant adenoviruses. Arch. Virol. — 2008. — 153: 891–897
- Morzaria, S. P.
A Field trial with a multicomponent inactivated respiratory viral vaccine /
S. P. Morzaria ,M. S. Richards ,J. W. Harkness et al. \\ The veterinary Record. — 1979. —v. 11. — № 3. — P. 410–414. - Narita, M., Immunohistopatologe of calf pneumonia induced by endobronchiak inoculation with bovine adenovirus 3. / M. Narita, M. Yamada, T. Tsuboi, K. Kawashima. //Vet. Pathol. — 2002. — 39: 565.
Yuan-Mao Zhu, Isolation, identification and complete genome sequence of a bovine adenovirus type 3 from cattle in China. /Yuan-Mao Zhu, ZuoYu, Hong Cai et al. // Virology Journal, 8, — 2011. — 557. — p. 1–8
Literaturе
- Belousova, R.
v. Vakcina protiv adenovirusnoj infekcii krupnogo rogatogo skota / R.v. Belousova // Veterinariya. — 1989. — № 9. — S. 23–25. - Gaffarov,
X. Z. Retrospektivnyj analizrespiratorno-kishechnyx virusov, cirkuliruyushhix sredi pogolov’ya krupnogo rogatogo skota v regione Srednego Povolzh’ya./X. Z. Gaffarov ,M. A. Efimova , L. Sh. Dupleva i dr // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinarnoj mediciny im. N. E'. Baumana. — Kazan'. — 2013. — T.216. — str.78–84. - Gunenkov,
v. V. Maloizvestnye virusnye infekcii krupnogo rogatogo skota /v. V. Gunenkov,v. N. Syurin,K. K. Vertinskaya //. — M.: MVA. — 1972. — 1–36 s. - Litvinov,
O. B. Antigennye i immunogennye svojstva inaktivirovannoj adenovirusnoj vakciny /O. B. Litvinov , R.v. Belousova, v. N. Syurin i dr. // — Trudy VIE’V: Problemy veterinarnoj immunologii. — 1983. — t. 57. — S. 116–119. - Syurin,
v. N. Virusnye bolezni zhivotnyx: adenovirusnaya infekciya krupnogo rogatogo skota //v. N. Syurin, A. Ya. Samujlenko. — Moskva. — VNITIBP. — 1998. — s.795–801. - Shemel’kova,
G. O. Specificheskaya profilaktika adenovirusnoj infekcii krupnogo rogatogo skota s ispol’zovaniem kombinirovannoj vakciny /G. O. Shemel ’kova,A. E. Verxovskaya ,G. L. Soboleva i dr. // Veterinariya Kubani. — 2013. — № 3. — S. 1/7 — 7/7. - Babiuk, L. A.
et al., Nucleotide sequence genome organization and transcription map of bovine
adenovirus type 3./
L. A. Babiuk et al. // J. Virol. — 1998. — 72:1394–1402. - Benkö, M.
Family Adenoviridae, virus taxonomy: 8th report of the international committee
on taxonomy of viruses. / M. Benkö, B. Harrach,
G. W. Both et al. // Academic Press, San Diego. — 2005. — p.213–228. - Bürki, F.
Experimental Adenovirus Vaccines in Cattle. / F. Bürki // J. Amer. Vet.
Med. Assoc. — 1973. —
v. 163. — № 7. — p.897–900. - Darbishire,
J. H. Dawson P. S. , Lamont P. H. et al., — A new adenovirus serotype of bovine origin. J.Comp. Pathol. — 1965 — 75: 327–330 - Gillespie, J. J Amer. Vet. Med. Assn. — 1973. — 163. — № 7. — 901
- Lehmkuhl, H. D., Habbs L. A. — Serologic and hexon phylogenetic analysis of ruminant adenoviruses. Arch. Virol. — 2008. — 153: 891–897
- Morzaria, S. P. A Field trial with a multicomponent inactivated respiratory viral vaccine /
S. P. Morzaria ,M. S. Richards ,J. W. Harkness et al. \\ The veterinary Record. — 1979. —v. 11. — № 3. — P. 410–414. - Narita, M., Immunohistopatologe of calf pneumonia induced by endobronchiak inoculation with bovine adenovirus 3. / M. Narita, M. Yamada, T. Tsuboi, K. Kawashima. //Vet. Pathol. — 2002. — 39: 565.
Yuan-Mao Zhu, Isolation, identification and complete genome sequence of a bovine adenovirus type 3 from cattle in China. /Yuan-Mao Zhu, ZuoYu, Hong Cai et al. // Virology Journal, 8, — 2011. — 557. — p. 1–8
Библиографическая ссылка
Гаффаров Х. З., Иванов А. В., Дуплева Л. Ш., Яруллин А. И., Ефимова М. А., Определение оптимальной иммунизирующей дозы ассоциированной вакцины, сконструированной на основе антигенов аденовируса